Мутантные ферменты

Вторая часть доказательства коллинеарности между нуклеотидной последовательностью в ДНК и последовательностью аминокислот в белках включала в себя определение полной аминокислотной последовательности триптофансинтетазы и картирование пептидных фрагментов мутантных ферментов (гл. 2, разд. 3,2). Пептидные карты позволили идентифицировать дефектные пептиды и точно установить природу аминокислотных замещений в большом числе различных ауксотрр-фов по триптофану. Когда это было сделано, оказалось, что мутациям, локализованным очень близко друг к другу, соответствовали аминокислотные замещения в непосредственно (или очень близко) прилегающих друг к другу участках полипептидной цепи. [c.251]

Благодаря допускам , люфтам , в устройстве химической машины организма имеются разнообразные возможности компенсации вредных мутаций иа метаболическом или гениом уровне. Приведем простейший пример. Допустим, что мутантный фермент участвует в некоторой метаболической цепи, обеспечивая скорость у производства промежуточного продукта, меньшую чем скорость и для дикого типа. Справедлива кинетика [c.559]

Другое важное наблюдение было сделано при структурном анализе-А-белка триптофан-синтазы у обратных мутантов Тгр+, полученных из Тгр -мутанта trpA23. У части таких обратных мутантов Тгр в 210-м. положении вместо вредного аргинина мутанта irpA23 был обнаружен нормальный глицин. Это хорошо согласуется с рассмотренной в гл. XIII возможностью того, что в результате обратной мутации восстанавливается исходная последовательность нуклеотидов в мутантном гене, а следовательно, и нормальная аминокислотная последовательность в соответствующем белке. Однако у некоторых других обратных мутантов в А-белке в 210-м положении оказался не нормальный глицин, а серин. Это наблюдение является прямым доказательством существования невидимых, мутаций , в случае которых, как это было предположено в гл. VI, мутационная замена одного аминокислотного остатка на другой остается незамеченной. Действительно, как видно из приведенного примера, некоторые замены аминокислот в первичной структуре полипептида (такие,, как замена глицина на аргинин в 210-м положении) приводят к полной потере каталитической функции А-белка триптофан-синтазы, тогда как другие замены в том же положении (такие, как замена глицина на серин) не мешают каталитической функции возникшего мутантного фермента [c.366]

Некоторая информация о событиях, вовлекаемых в процесс сохранения двойных микрохромосом, получена благодаря изучению нестабильных клеточных линий, в которых амплифицированные гены кодируют мутантный фермент DHFR. Мутантный фермент не присутствует в исходной (диплоидной) линии клеток следовательно, мутация должна была возникнуть в какой-то момент процесса амплификации. Несмотря на вариации в числе амплифицированных генов, эти клетки обладают только мутантным ферментом. Следовательно, хромо- [c.499]

Замена в трипсине остатка Asp102 на Asn [31851 методом направленного му тагенеза приводит к сильному (в 10 раз) падению активности в нейтральной среде. Мутантный фермент почти не отличается по структуре от нативного [21241. [c.309]

Даже замена одной аминокислоты на другую в результате так называемых миссенс-мутаций, сильно нарушает стабильность белков. Применение иммунологических методов показало, что около половины таких мутаций, полученных в гистидиновом опероне. S. typhimurium, приводят к деградации мутантных ферментов. Оказалось также, что у многих температурно-чувствительных мутантов утрата функции при повышении температуры связана с протеолизом измененных белков. [c.52]

Нарушение ферментативной активности характеризовалось семикратным снижением и измененной эффективностью связывания с цАМФ мутантного фермента по сравнению с ферментом исходной линии. Протеинкиназный мутант дает скудный стероидогенный ответ на АКТГ и цАМФ. Блокады роста и морфологических изменений, вызываемых этими агентами, в исходной линии клеток не происходит. Эти результаты наводят на мысль, что цАМФ-зависимая протеинкиназа важна для регуляции стероидогенеза в надпочечниках, морфологии и роста под влиянием адренокортикотропного гормона (Gutman et al., 1978). [c.238]

В простом случае, когда объектом поиска является мутантный фермент с измененной субстратной специфичностью, его можно отделить от остальных производных на колонке с иммобилизованным аналогом субстрата, который должен специфически распознаваться этим, но не исходным ферментом. Отбор с использованием ингибиторов, полученных на основе аналогов субстратов, был успешно применен, в частности, для мутантных производных нуклеазы стафилококков с целью изменения ее специфичности. Нуклеаза стафилококков является Са2+-зависи-мой фосфодиэстеразой, гидролизующей ДНК с небольшим предпочтением к остаткам тимидина на 5 -конце расщепляемой связи. Из клонотеки, содержащей мутагенизированный с помощью ПЦР ген нуклеазы, выделяли ферменты с повышенным сродством к иммобилизованным олигонуклеотидам, построенным из фосфоротиоатных аналогов тимидина или гуанидина. Такие производные олигонуклеотидов устойчивы к действию данной нуклеазы. Некоторые производные нуклеазы, выделенные с помощью этого метода на тимидиновом субстрате, обладали аналогичной удельной активностью, что и фермент дикого типа, тогда как удельная активность мутантных ферментов с повышенным сродством к олиго(С) была в 10 раз ниже. Одновременно проис- [c.346]

ОКИСЛЯТЬ бензиламин, с помощью направленной эволюции придали способность использовать в качестве субстрата стереоизомер (5)-а-метилбензиламин. Полученный таким образом мутантный фермент (А8п3368ег) оказался в 50 раз более активным в отношении (5)-а-метилбензиламина, чем исходный, и в семь раз превышал его энантиоселективность. Использование этого фермента в сочетании с восстанавливающим агентом позволило дерацемизировать рацемическую смесь а-метилбензиламина с выходом 73% (/ )-энантиомера и 93%-ным избытком энантиомера (ее). [c.446]

Вероятно, на самом деле последствия таких мутационных замен аминокислот могут быть более значительными. Начнем с того, что внимание исследователей, изучающих свойства мутантных ферментов, как правило, целиком направлено на изучение влияния мутаций на его основную активность. При этом не учитывается возможность появления новой ферментативной активности, которая остается незамеченной просто потому, что исходно неизвестно, появления какой активности следует ожидать. А между тем при ближайшем рассмотрении такие последствия почти любой миссенс-мутации (точковой мутации, которая приводит к замене одного осмысленного кодона на другой) в структурной части гена, кодирующего полипептидную цепь, кажутся весьма вероятными. Действительно, в природе, по-видимому, не существует ферментов с абсолютной субстратной специфичностью, и полифункциональность является изначальным и фундаментальным свойством сложных полипептидов. Какой бы узкой ни была субстратная специфичность ферментов по отношению к природным субстратам, для них всегда можно синтезировать искусственные субстраты, расширяющие их субстратную специфичность. Полифункциональность описана для многих природных белков. Например, кристаллины (одни из основных белков хрусталика глаза позвоночных) у млекопитающих являются одновременно малым белком теплового шока неизвестной функ- [c.447]

Первые результаты [58] показали, что при замене цистеина-35 на серин значение для АТР увеличивается в 4,5 раза. Аналогичная замена на глициновый остаток также приводит к понижению ферментативной активности [56]. Как известно из кристаллографических исследований, цистеин-35 образует водородную связь с рибозным кольцом АТР таким образом, неудивительно, что введение глицинового остатка приводит к снижению активности. На первый взгляд результаты, полученные с серином, кажутся странными, поскольку можно было бы ожидать, что способность гидроксила к образованию более прочной водородной связи (по сравнению с сульфгидрильной группой) приведет к усилению связывания АТР. Однако в безлигандном ферменте водородные связи образуются с молекулами воды. Разные стерические требования для сульфгидрильной и гидроксигрупп означают, что в мутантном ферменте связывание АТР приводит к замене сильной водородной связи на гораздо более слабую, откуда и следуют наблюдающиеся изменения способности к связыванию АТР и катализу [56]. [c.104]

Позже [17] был проведен тонкий структурный анализ мутантных ферментов, полученных заменой треонина-51 на аланин, цистеин или пролин. Детальное кинетическое исследование мутантов показало, что максимальная активность каждого из них зависит от концентрации АТР. Как известно, в тирозил-тРНК-синтетазах из разных [c.104]

Недавно сравнение свойств ряда мутантных ферментов использовали [18] для выяснения роли водородных связей в специфичности тирозил-тРНК-синтетазы. Систематически варьируя аминокислотные остатки, авторы смогли установить вклад водородных связей в связывание АТР и тирозина и специфичность фермента к этим субстратам. Они заключили, что удаление остатка, образующего водородную связь с незаряженной группой субстрата, приводит к снижению энергии связывания последнего лишь на 2-6 кДж/моль если же водородная связь образуется с заряженной [руппой, наблюдается значительно больший эффект, до 16кДж/моль. В недавней работе [55] показано, что водородные связи играют важную роль и в преимущественном связывании субстрата в переходном, а не в основном состоянии. [c.105]

Пример 11-3. Измерение изменений величины мутантного фермента. Многие методы, применяемые для определения молекулярных масс ферментов, требуют образцов с высокой степенью очистки (например, метод седиментационного равновесия, который будет описан позже) или при использовании не очень чистых образцов дают массы субъединиц (например, ДСН-гель-электрофорез, гл. 9). Использование зональной седиментации позволяет определить молекулярную массу активного фермента непосредственно в неочищенном лизате при применении в качестве метода контроля анализа ферментативной активности. Например, ДНК-полимераза I Е. oli седиментирует при 5 = 5,4. Зоны полимери-зующей и 5 —З -экзонуклеазной активности, связанные с этим белком, седиментируют вместе, поэтому для локализации фермента в градиенте сахарозы можно использовать любую из них. Мутантная форма фермента не обладает полимеразной активностью, однако сохраняет 5 —З -экзонуклеазную. Как следует из рис. 11-26, мутантный фермент обладает значением s = 2,8. Поскольку данная мутация является терминирующей цепь белка, пониженное значение 5 указывает на то, что данный фермент является лишь небольшим фрагментом белка дикого типа и имеет только 0,4% активности. [c.314]

Если желаемым продуктом является выделяемый клеткой фермент (чаще всего это гидролитические ферменты, хотя в последнее время большой интерес проявляется и к ряду оксидоре-дуктаз, в частности, участвующих в катаболизме аминокислот), то мутации, способствующие усилению его образования и активности, а также накоплению в среде, могут затрагивать 1) структурный ген, приводя к синтезу мутантного фермента, не чувствительного к ингибированию конечным продуктом реакции, и (или) повышая его активность (число оборотов, т. е. число молей превращаемого субстрата в минуту) мутация в промоторной части гена должна усилить частоту инициации транскрипции или вызвать конститутивный синтез фермента 2) гены, кодирующие белки, участвующие в регуляции синтеза данного фермецта (в частности, по типу катаболитной репрессии, имеющей разнообразные формы проявления и в общем виде выражающейся в обратной зависимости синтеза катаболитчувствительного фермента от скорости роста клеток), мутации в этих генах должны устранить или ослабить факторы, ограничивающие синтез фермента 3) гены, кодирующие ферменты, которые могут гидролизовать и инактивировать нужный фермент, мутации должны уменьшить или устранить такую возможность 4) гены, ответственные за синтез компонентов клеточных мембран, которые участвуют в сборке (у эукариотов) и экскреции ферментов, мутации в этих генах могут повысить эффективность указанных процессов. [c.79]

Смотреть страницы где упоминается термин Мутантные ферменты: [c.368] [c.184] [c.184] [c.318] [c.199] [c.79] [c.46] [c.317] [c.329] [c.402] [c.439] [c.440] [c.441] [c.445] [c.449] [c.452] [c.104] [c.105] [c.105] [c.315] [c.114]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология