Стартовый гель

При исследовании рибосомных белков методом двухстороннего электрофореза [654] авторы помещали пробу между двумя разделяющими гелями. Столбик геля приготавливали в следующей последовательности разделяющий гель -- концентрирующий гель — стартовый гель — концентрирующий гель — разделяющий гель. [c.101]

Рис. 111. Корреляция между классами липопротеидов сыворотки, различаю шимися по плотности, и фракциями липопротеидов, полученными с помощью различных электрофоретических методов [769]. А. Электрофорез на бумаге, о. Электрофорез в агарозном геле. В. Электрофорез на ацетате целлюлозы. Л Электрофорез в полиакриламидном геле. — хиломикроны, ЛОЯЯ —липиды с очень низкой плотностью, ЛЯЯ —липиды с низкой плотностью, ЛВП— липиды с высокой плотностью, / — стартовый гель, 2—концентрирующий гель, 3 — разделяющий гель.

Далее готовят разделяющий гель. Поверхность концентрирующего геля дважды быстро промывают смесью для получения разделяющего геля, а затем с помощью шприца заполняют трубку этой смесью так, чтобы получился выпуклый мениск, стараясь избежать образования пузырьков воздуха. Затем конец трубки плотно заклеивают полимерной пленкой. Всю эту процедуру необходимо провести в течение 5 мин после образования концентрирующего геля. Как только полимеризация закончится (через 30—40 мин), осторожно снимают колпачок, переворачивают трубку и аккуратно вставляют ее в резиновый колпачок нижним концом. Из другого конца, ставшего теперь верхним, удаляют раствор сахарозы и промывают поверхность концентрирующего геля смесью такого же состава. Затем наносят образец, включенный в смесь для приготовления стартового геля, и осторожно наливают электродный буфер до верхнего края трубки, не допуская перемешивания двух слоев. [c.263]

После этого проводят фотолиз стартового геля, как описано выше. Всю эту процедуру можно легко про- [c.263]

Разделяющие гели можно хранить в течение нескольких дней, но после добавления концентрирующего геля и исследуемого образца в стартовом геле электрофорез следует начать не позже, чем через 1 ч. Электродные буферы можно использовать многократно, но анодный и катодный буферы необходимо хранить отдельно. После нескольких анализов или при изменении pH приготавливают свежие буферные растворы. Гели анализируют либо непосредственно в трубках, либо после извлечения из них. [c.264]

Концентрирующий и стартовый гели [c.266]

Значение pH концентрирующего и стартового гелей должно быть на 2—3 единицы pH ниже, чем р/Са замыкающего иона. [c.87]

Для приготовления разделяющего геля удобно использовать основание, имеющее p (a приблизительно на одну единицу ниже, чем его pH. Это обеспечивает высокую буферную емкость разделяющего геля. (Концентрирующий к стартовый гели можно готовить вообще без применения буферных растворов.) [c.87]

Разработано много систем, в которых либо не требуется предварительного концентрирования компонентов пробы, либо его невозможно провести до фракционирования в разделяюще м геле. В таких системах концентрирующий и стартовый гели вообще отсутствуют, а исследуемый образец, содержащийся обычно в. растворе сахарозы более высокой плотности, чем электродный буфер, наслаивают непосредственно на поверхность разделяющего геля. [c.90]

Электрофорез проводят либо в цилиндрических колонках, заполненных гелем (в стеклянных трубках), либо на пластинках размерами 10ХЮ см, покрытых слоем геля толщиной 1—4 мм. Гель состоит из трех слоев внизу располагается разделяющий гель, в середине — концентрирующий (гель-прокладка) и вверху — стартовый гель, содержащий образец. Каждый слой представляет собой полиакриламид с определенной степенью сшивки. Гель образуется в трубке или на пластинке из раствора, содержащего акриламид (мономер), М,М -ме-тиленбисакриламид (БИС), буфер, сшивающий и поли-меризующий агенты. Полимеризацию катализируют либо химическим способом, используя персульфат аммония, либо фотохимическим — с помощью света, который вызывает образование свободных радикалов в присутствии кислорода. [c.259]

Использование персульфата для полимеризации позволяет получать гели с различной пористостью и электрофоретическими свойствами. Поэтому важно, чтобы полимеризация проходила при стандартных условиях. Персульфат может вызывать артефакты, которых легко избежать, если заменить персульфат рибофлавином и использовать фотолитическую полимеризацию вместо химической или применять восстанавливающие агенты, например тиогликолат (0,01—0,001 часть на 1 часть глицина в буфере). С той же целью можно добавлять мер-каптоэтанол (5 мМ) в концентрирующий и стартовый гели и в верхний буфер. Для удаления персульфата и других примесей иногда проводят предварительный электрофорез, но это нарушает прерывистость электрофоретической системы, превращая ее в однородную систему, что не всегда позволяет достичь нужного разрешения. [c.266]

В ко]щентрирующем и стартовом гелях белки должны концентрироваться в результате изотахофореза [942]. При тех значениях pH, которые имеют эти гели, буферный (замыкающий) ион, находящийся в электродных сосудах, должен иметь наименьшую электрофоретическую подвижность. [c.86]

Приготовление пробы. По мнению Дэвиса [281], включение исследуемой пробы в стартовый гель препятствует тепловой конвекции диффузии веществ, что приводит к более эффективному разделению. Однако некоторые белки повреждаются в результате полимеризации геля [1407] или под действием флуоресценции [975]. Кроме того, белки могут подавлять полимеризацию геля [570]. Если есть подозрение, что флуоресценция или персульфат (см. ниже) приводят к возникновению артефактов, вместо стартового геля желательно использовать суспензию сефадекса 0-200, гл1ицв рин, сахарозу или мочевину. В то же время эти материалы сам и способны при определенных условиях стать причиной артефактов. Так, сефадекс 0-200 может задерж1И1вать движение белков [173], а сахароза — взаимодействовать с 8-аминогруппой лизина [455] или боратом с образованием отрицательно заряженного комплекса. Поэтому присутствие сахарозы в боратном буфере может привести к эффекту усеченного конуса и боковому распространению белков в процессе электрофореза [759]. С другой стороны, мочевина вызывает диссоциацию белков на субъединицы, препятствует затвердению агарозы в агарозно-полиакриламидных гелях [574] и влияет на активность водородных ионов. [c.97]

В исходном методе Кальтшмидта и Уитмена [654] разделение рибосомных белков в первом направлении проводили при pH 9,6 или 8,6 в стеклянных трубках длиной 180 мм и диаметром 5 мм. Образец белка (1—4 мг) помещали в середину трубки, включая его в слой геля, образующегося путем фотополимеризации. В этих условиях одни рибосомные белки мигрировали к катоду, а другие — к аноду. Использованный на первом этапе 8%-ный полиакриламидный гель не обладал сколько-нибудь заметным свойством молекулярного сита. По окончании электрофореза примерно через 36 ч гели извлекали из стеклянных трубок и вымачивали в ацетатном буфере для стартового геля,, применяемом при электрофорезе во втором направлении. Этот [c.312]

Из-за сложности манипулирования с мягкими гелями большинство исследователей предпочитает окрашивать липопротеиды перед электрофорезом (предварительное окрашивание). С этой целью краситель включают в стартовый гель или смешивают с образцом и перед электрофорезом центрифугируют [1066, 1445]. Недостаток методов предварительного окрашивания состоит в том, что они не позволяют достаточно надежно определять хиломикроны. Стартовый гель может окрашиваться избытком красителя, не связанного с липопротеидами, в результате чего создается ложное впечатление присутствия на электрофореграмме хиломикронов [373, 1445]. Чтобы облегчить визуальное обнаружение хиломикронов, Наито и др. [899] рекомендуют использовать для предварительного окрашивания разбавленный раствор суданового черного в этиленгликоле и одновременно снижать концентрацию рибофлавина в стартовом и концентрирующем гелях. Маскет и др. [830] предотвратили появление ложных зон хиломикронов, применив раствор суда-нового черного В в водном растворе диэтиленгликоля. Для поддержания красителя в растворенном состоянии они добавляли небольшое количество твина 20. Новый подход к предваритель- [c.358]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология