Гель-электрофоретическая система

Гель-электрофоретическая система [c.153]

Диск-электрофорез с прослойкой из сефадекса. При изучении липопротеидов [707] была использована электрофоретическая система, состоящая из нескольких слоев акриламидного геля и сефадекса. [c.101]

Электрофорез в полиакриламидном геле, вероятно, является наиболее гибкой и используемой электрофоретической системой [c.230]

Обычно, когда раствор переходит в гель, физические и химические свойства системы изменяются мало, за исключением очевидного появления механической структуры. Электропроводность геля в присутствии электролитов фактически та же, что и в жидкости. Если же содержание электролита в растворе желатины очень мало, то раствор имеет несколько большую проводимость, чем гель. Фрейндлих и Абрамсон нашли, что электрофоретическая подвижность частиц кварца одинакова как в геле желатины, так и в растворе желатины. [c.384]

При изучении системы трансферрин — кональбумин у домашней птицы было показано, что железосвязывающие белки могут синтезироваться во многих тканях и что ген трансферрина может определять синтез различных форм белка в разных тканях. У цыплят описана гетерогенная популяция железосвязывающих белков, подобная той, которая наблюдается при сравнении белков сыворотки крови и СМЖ у человека [60]. Трансферрин сыворотки курицы и кональбумин яичного белка сходны по иммунологическим свойствам и аминокислотному составу. Оба белка образуют аналогичные продукты после обработки трипсином и химотрипсином, и тот и другой содержат аланин в качестве N-концевой аминокислоты. Генетически обусловленный полиморфизм трансферрина сыворотки цыпленка отражается в соответствующем полиморфизме кональбумина яичного белка [69]. Генетические вариации трансферрина сыворотки птиц были описаны Мюллером и сотр. [70]. Вильямс [60] показал, что обработка нейраминидазой не оказывает влияния на электрофоретическую подвижность кональбумина в крахмальном геле. Однако тот же фермент уменьшает подвижность двух компонентов трансферрина сыворотки цыпленка, образуя компоненты, соответствующие по подвижности компонентам кональбумина. Это позволило автору предположить, что трансферрин и кональбумин отличаются только по содержанию сиаловой кислоты в углеводных простетических группах. Основываясь на данных, полученных в опытах по включению меченых аминокислот в кональбумин в срезах яйцеводов, тот же автор [60] постулировал, что ген трансферрина у птиц определяет синтез как трансферрина (в печени), так и кональбумина (в яйцеводах). [c.126]

В последнее время широкое распространение получили системы видеосъемки электрофоретических гелей с цифровой записью и расшифровкой результата. В состав такой системы обычно входит персональный компьютер, цифровая видеокамера с объективом с переменным фокусным расстоянием, увеличивающей линзой и специальным УФ-фильтром, а также цифровая видеокарта для персонального компьютера. [c.204]

Рис, 7. Схематическое изображение устройства для зонального электрофореза в свободной среде. I — электродные сосуды 2 мотор, вращающий электрофоретическую трубку (5) пробка из геля. Положение УФ-поглощающих зон (5) определяли при помощи оптической сканирующей системы (6, 7, 8). [c.24]

Приготовление пробы. Обычно препаративный электрофорез в полиакриламидном геле не используют в качестве одного из начальных этапов в очистке белков и нуклеиновых кислот. Для предварительного грубого фракционирования компонентов омесей применяют методы хроматографии, высаливания или осаждения. Чтобы провести электрофоретическое разделение, пробу необходимо сконцентрировать до 5 мл для однородной системы и до 10—20 мл для неоднородной. От избытка солей можно избавиться при помощи диализа или гель-фильтрации. Концентрация солей в исследуемом растворе должна быть такой же, как в буфере концентрирующего геля. Если же этот гель не попользуется, то пробу диализуют против буфера разделяющего геля, разведенного в 5 раз. Медленное вхождение пробы в гель во время электрофореза свидетельствует о слишком высокой концентрации солей. Любой осадок, присутствующий в пробе, следует удалять центрифугированием или фильтрованием через миллипоровый фильтр, так как он может закупорить разделяющий гель. [c.117]

Для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот применяют также неоднородные буферные системы [387, 1087]. При электрофорезе в комбинированном полиакриламидно-агарозном геле применяли трис-боратный буфер [983]. Электрофоретические свойства нуклеиновых кислот, а значит, и их разрешение при электрофорезе в какой-то степени зависят от используемой буферной системы [778, 1004, 1070]. По нашему мнению, в каждом конкретном случае наиболее подходящий буфер [c.372]

Фирма LKB рекомендует примешивать к исходному белковому препарату в качестве спейсеров амфолины. Отличие от ИЭФ здесь в том, что амфолины вносят не в объем геля или жидкости, в которых проводят электрофорез, а только в исходный препарат, причем в таком количестве, которого недостаточно для обеспечения проводимости по всему объему фракционирования. В отличие от ИЭФ, в этом случае зоны расположения амфолинов не перекрываются и сами они не разряжаются, не формируют градиента pH, а мигрируют в качестве ионов наряду с белками, встраиваясь между ними в цепочку зон с убывающей электрофоретической подвижностью. Все амфолины в этой системе несут заряд одного знака, но в зависимости от своих р1 различаются по величине этого заряда, образуя тем самым широкий набор спейсеров с различными электрофоретическими подвижностями. При этом pH среды, в которой идет миграция, определяет буферный противоион. [c.77]

Наиболее полное разделение смеси белков на индивидуальные компоненты достигается с помощью электрофоретических методов. Как уже обсуждалось в разд. 5.2, проведение препаративного электрофореза, несмотря на то что он обладает значительными теоретическими преимуществами, сопряжено с большими трудностями. Поэтому он используется не часто. В аналитическом же варианте электрофорез — это один из наиболее широко применяемых методов исследования. Действительно, чтобы охарактеризовать очищенные препараты белков, их теперь почти обязательно подвергают электрофоретическому анализу. Для проведения аналитического электрофореза в гелях требуется всего 5—25 мкг белка это обычно не слишком значительная часть полученного препарата. До того как были предложены гелевые системы, электрофоретический анализ проводили в аппарате Тизелиуса методом движущейся границы. Хотя для этого приходилось расходовать десятки миллиграммов белка, разделения очень сходных белков не достигалось и анализ каждого образца требовал больших усилий и внимания. Затем был разработан аналитический электрофорез на бумаге и других целлюлозных материалах, используемых в качестве носителей, что исключило два из указанных выше недостатков метода Тизелиуса количество необходимого для анализа белка значительно сократилось и проводить электрофорез стало намного легче, так как для этого метода требуется только простое оборудование. Однако разрешение осталось примерно таким же, как н прежде, даже при использовании обладающих хорошими качествами современных ацетатцеллюлозных пленок это объясняется тем, что разделение компонентов смеси происходит в соответствии только с приблизительной величиной отношения заряд/размер и многие белки движутся вместе в виде одной зоны (ср. с разд. 5.2). [c.316]

Это четвертый электрофоретический метод, который также широко используется в настоящее время. Он сходен с гель-электрофорезом в присутствии ДСН в том отношении, что белки в данном случае также разделяются только в соответствии с их размерами, а не по величине зарядов 182]. Концентрация акриламида изменяется по длине пластинки от самого высокого значения (обычно около 30%) в нижней ее части до всего лишь 3% в верхней. Буфер выбирается с высоким значением pH, так что в большинстве своем белки мигрируют в геле к аноду (вниз). Электрофорез длится до тех пор, пока каждый белок не достигнет такого участка в геле, где из-за слишком малых размеров пор он уже не сможет двигаться дальше. Например, небольшие белки могут дойти до участка, содержащего 25% акриламида, а крупные останутся вблизи старта (верхняя часть геля). Как и в системе с ДСН, при электрофорезе в градиентном геле можно определить размеры молекул, если прокалибровать гель с помощью смеси стандартных белков. Однако в данном случае эти размеры будут относиться к нативным белкам, а не к их субъединицам. Система электрофореза в градиентном геле сходна со следующим, пятым методом — изоэлектрическим фокусированием процесс продолжается до тех пор, пока не прекратится перемещение всех белков и пока не завершится фокусирование , или концентрирование, диффузных белковых зон, в результате чего будет достигнута очень высокая степень разрешения. [c.323]

Гомогенность образца по молекулярной массе может быть установлена с помощью методов ультрацентрифугирования или гель-фильтрации. Но эти методы менее чувствительны по сравнению с каскадными методами, в которых разделение макромолекул зависит от их суммарного заряда. Для установления чистоты белков, пептидов и олигонуклеотидов очень полезны методы зонного электрофореза, особенно при изучении электрофоретического поведения образца в нескольких буферных системах с различными значениями pH. С помощью ионообменной хроматографии также можно обнаружить присутствие примесей. Распределительная хроматография и противоточное распределение были успешно использованы при изучении лишь немногих белков из-за ограниченной растворимости и относительной нестабильности большинства белков в неполярных растворителях. Чистоту пептидов, содержащих до 40— 50 остатков аминокислот, можно во многих случаях установить с помощью хроматографии на бумаге. Часто макромолекулярное вещество, кажущееся гомогенным при исследовании одним мето- ом, оказывается негомогенным при использовании другого метода. На- [c.164]

Использование персульфата для полимеризации позволяет получать гели с различной пористостью и электрофоретическими свойствами. Поэтому важно, чтобы полимеризация проходила при стандартных условиях. Персульфат может вызывать артефакты, которых легко избежать, если заменить персульфат рибофлавином и использовать фотолитическую полимеризацию вместо химической или применять восстанавливающие агенты, например тиогликолат (0,01—0,001 часть на 1 часть глицина в буфере). С той же целью можно добавлять мер-каптоэтанол (5 мМ) в концентрирующий и стартовый гели и в верхний буфер. Для удаления персульфата и других примесей иногда проводят предварительный электрофорез, но это нарушает прерывистость электрофоретической системы, превращая ее в однородную систему, что не всегда позволяет достичь нужного разрешения. [c.266]

Стегинк и др. [1231] разработали еще одну электрофоретическую методику для разделения цепей глобина. Эти авторы модифицировали предложенный ранее [963] метод электрофореза в полиакриламидном геле в системе мочевина — уксусная кислота. [c.327]

Для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот среднего размера обычно применяют агарозные гели. Агароза — это особо чистая фракция, получаемая из агара или непосредственно из агарообразующих морских водорослей. В 1,0% агарозном геле можно разделять молекулы ДНК размером от 600 до 20 ООО п. н. Для фракционирования более крупных молекул ДНК (миллионы пар оснований), денатурированной ДНК и РНК приходится использовать специальные системы электрофореза. Иногда для решения специальных задач для разделения ДНК применяют полиакриламидные гели. Так, в 20% полиакриламидном геле можно разделить фрагменты ДНК, состоящие всего из шести оснований и различающиеся лишь одним нуклеотидом. [c.54]

Для разделения канамицинов были использованы методы бумажной хроматографии [39, 52—55], ТСХ [39, 54], электрофореза [56], ГЖХ [57] и ВЭЖХ [58]. Производные канамицина и его биосинтетические продукты были разделены с помощью бумажной хроматографии [59, 60] и ТСХ [60—63]. Для разделения компонентов неомицина и его N-ацетилпроизводных были применены разнообразные системы бумажной хроматографии. [39, 60, 64—75]. Для этой же цели пригодны тонкослойные пластинки с силикагелем [75—79], углем [80], оксидом алюминия [81, 82], целлюлозой MN-300 [76, 83] и с кизельгуром [76]. Электрофоретическое разделение неомицинов осуществлено на ацетате целлюлозы [84, 85], на бумаге ватяан № 3 ММ [46] и в полиакриламидном геле [86]. Описан также газохроматографический анализ неомицинов [87, 88]. [c.147]

В нашей лаборатории также начаты исследования некоторых сильнокислых белков ткани нервной системы (Смерчинська и др., 1972). Выявлены три фракции сильпокислых белков, мигрирующих при электрофорезе в агаровом геле далеко впереди двух преальбуминовых фракций. По нарастанию электрофоретической подвижности эти фракции обозначены как 1а, 16, 1в. Последняя из них получена в очищенном виде. Показана микрогетерогенность выделенных фракций и изучена их метаболическая активность. [c.26]

Электрофоретическое разделение исследуемых веществ можно также осуществлять на пластинах полиакриламидного геля размерами ЮОХЮО мм при толщине слоя геля от 1 до 3,5 мм. Пластины с углублениями для внесения образцов приготавливают на особых подставках. Для проведения электрофореза требуется специальное оборудование. Конструкция прибора позволяет устанавливать пластины в вертикальное положение при этом канавки для образцов должны быть расположены у верхнего края пластины и контактировать с верхним буфером, тогда как противоположный край пластины должен находиться в контакте с нижним буфером. Необходимо обеспечить циркуляцию охлаждающей жидкости по поверхности пластины с обеих ее сторон. Основное достоинство этой системы заключается в том, что она позволяет проводить одновременное разделение нескольких образцов в одинаковых условиях, благодаря чему их легко можно сравнивать между собой. Считается, что пластины легче анализировать с помощью денситометра, однако для этого необходимо иметь специальный прибор. Кроме того, пластинки можно без особого труда разрезать на полоски и проанализировать их на наличие различных компонентов путем окрашивания или определения радиоактивности. Полоски можно также высушивать и хранить. Однако для приготовления пластин требуется больше акриламида, особенно если анализируется немного образцов. Как и в случае электрофореза в трубках, для данного метода разработан целый ряд однородных и неоднородных ( прерывистых ) буферных систем. Здесь применяются те же способы приготовления гелей, методики разделения и анализа, что и при электрофорезе в трубках. [c.265]

Самый простой способ обеспечения стабильности электрофоретических зон заключается в том, что в среду для электрофореза вводят вещества, образующие капиллярную структуру. Ан-тиконвекционные свойства такой системы весьма высоки, если площадь поперечного сечения капилляров достаточно мала, так как в канале круглого сечения скорость потока снижается пропорционально четвертой степени радиуса. В качестве поддерживающей среды чаще всего используются фильтровальная бумага, пленки из ацетата целлюлозы, колонки или блоки целлюлозного порошка, гранулированный крахмал или гранулы поливиниловых полимеров, а также агаровый, агарозный, крахмальный или полиакриламидный гели. Зональный электрофорез в поддерживающей среде имеет ряд важных преимуществ. При его проведении можно использовать какой-либо простой и сравнительно недорогой прибор и анализировать одновременно несколько различных препаратов. Процедуры визуализации зон и выделения фракций осуществляются довольно легко. Вещества, обладающие биологической активностью, можно выявить непосредственно на электрофореграммах. Метод легко приспособить как для крупномасштабного разделения веществ, так и для микроразделения. Удается достигнуть очень высокой разрешающей силы, особенно в среде, характеризующейся одновременно антикон векционными свойствами и эффектом молекулярного сита. [c.34]

При использовании этого метода мембраны сначала солюбилизируют 1%-ным раствором ДСН. Этот детергент разрушает большинство белок-белковых и белок-ли-пидных связей. Далее полученный раствор наслаивают на полиакриламидный гель, также содержащий ДСН, и все это помещают на несколько часов в электрическое поле. В этой системе в отличие от других, не содержащих ДСН, электрофоретическая подвижность большинства белков зависит от их массы, а не от заряда. Дело в том, что отрицательный заряд молекул ДСН, присоединенных к белку, намного превышает общий заряд самого белка. Полосы разделившихся белковых фракций проявляют, обрабатывая гель краской типа кумасси си- [c.208]

Впервые успешное электрофоретическое разделение рибосомных белков было описано Уоллером [1369]. Электрофорез проводили в крахмальном геле, используя ацетатный буфер (pH 5,1) содержавший 6—8 М мочевину. В этой системе белки, экстрагированные из 705-рибосом Е. соН, были разделены на 24 зоны. Электрофорез в крахмальном геле применяли также для разделения рибосомных белков млекопитающих [936, 1268]. [c.310]

Церулоплазмин (система Ср). Показано, что переносящий медь гликопротеид плазмы также существует в нескольких формах, обладающих различной электрофоретической подвижностью. Вариантные фенотипы довольно часто встречаются в популяциях негроидов и очень редко у европеоидов. Шреффлер и др. [1146] применяли для определения фенотипа церулоплаз-мина горизонтальный электрофорез в крахмальном геле с бо-ратным буфером (pH 9,5). Образцы сыворотки в разведении 1 3 (по объему) подвергали электрофорезу при 4 °С и напряжении 7 В/см. Для окрашивания церулоплазмина может быть использована его оксидазная активность. Шреффлер и др. [1146] окрашивали церулоплазмин 0,1%-ным раствором о-дианизидина в 0,04 М ацетатном буфере (pH 5,5), содержащим 20% этанола. Фрагменты геля инкубируют в этом растворе [c.340]

Для электрофоретического разделения гликозаминогликанов разработано несколько систем, в которых в качестве поддерживающей среды используются фильтровальная бумага, ацетат целлюлозы, агарозный или полиакриламидный гель. В 1953 г. Риниц [1090] описал электрофоретическое разделение гиалуроновой кислоты и хондроитинсульфатов на фильтровальной бумаге в натрий-фосфатном буфере (pH 6,7). Харуки и Кирк [521] отделили хондроитинсульфат В от хондроинтинсульфа-тов А и с путем электрофореза на бумаге в растворах сульфата или ацетата цинка. В настоящее время наилучщее разделение гликозаминогликанов дает электрофорез на полосках ацетата целлюлозы в следующих системах растворителей [c.395]

В работе [45] описан другой метод десорбции связавшегося материала с матрицы с использованием изоэлектрического фокусирования. Аффинный гель помещается в предварительно фокусированный градиент pH, который получают электрофорезом плоского слоя амфолитсодержащего геля. Система работает при низкой силе тока и высоком напряжении. Хотя ни этот метод, ни электрофоретическая десорбция по существу не были оптимизированы, оба метода открывают возможность проводить десорбцию в мягких условиях даже в случае систем с высоким сродством, таких, как биотин — авидин и антиген — антитело. [c.121]

Вестерн-блоттинг—это метод иммунологического выявления электрофоретически разделенных антигенов, связанных с твердой подложкой. В качестве подложки используют нитроцеллюлозный фильтр [8]. Разделение обычно проводят методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН. Такая система позволяет разделить белки по их мол. массе, что повышает ценность метода, поскольку можно получить данные [c.357]

Для получения препаратов высокоочищенного кининогена применяют метод элюции белка с геля после электрофоретического разделения препарата. Используют либо упомянутую стандартную систему Дэвиса, либо разделяют белки по методу Шапиро (Shapiro е. а., 1967) в специально подобранной системе. В последнем случае 3 мг препарата кининогена, полученного из фракции 46 (15 Е/мг), растворяют в 1,5 мл 0,1% раствора додецилсульфата натрия (SDS), выдерживают 12 ч при 37°С, наносят на 12 колонок (6ХЮ0 мм) с 8,5% гелем, приготовленным на 0,1 М трис-НС1 буфере (pH 8,0), содержащем 0,1 % SDS, и подвергают электрофорезу в аппарате фирмы Reanal Модель 69 при силе тока [c.178]

М мочевины часто используют для электрофоретического фракционирования гистонов [Рапу1т, СЬа1к1еу,- 1969]. Молекулярные массы гистонов лежат в диапазоне 11—22 тыс. дальтон, поэтому для их разделения используют мелкопористые гели (7 = 15 -20). Положительно заряженные в кислой среде гисто-ны мигрируют в направлении катода. Наибольшей подвижностью обладает гистон Н4, затем следуют Н2А, Н2В и НЗ, которые в этой простой системе разделяются довольно плохо. От них заметно отстает относительно более крупный гистон Н1. В качестве лидирующего красителя используют пироиии. [c.55]

Выход белков из геля на фильтр можно значительно ускорить, использовав электрофоретическую элюцию белков из пластины геля в поперечном направлении, подобно тому, как это было описано для электрофоретической отмывки красителя [Towbin et al., 1979]. Для этого собирают такую же систему, как в предыдущем варианте, с тем лишь отличием, что нитроцеллю-лозный фильтр ( Millipore НА ) накладывают на гель только с одной стороны — той, куда будут мигрировать белки под действием электрического поля. Весь сэндвич помещают в прибор для электрофоретической отмывки геля и подбирают напряжение так, чтобы напряженность поля в геле составляла около 6 В/см. Если электрофорез белков вели в отсутствие ДДС-Na (например, с мочевиной), то предварительное вымачивание геля и всех компонентов системы, а также саму элюцию можно вести в 0,7 /о-ной уксусной кислоте. За 1 ч белки полностью выходят из геля в направлении катода и прочно сорбируются на нитроцел- [c.107]

Боде (Bode, 1977] проводил полимеризацию акриламида из его 7,5%-НОГО раствора в 0,1 М фосфатном буфере (без добавления метиленбисакриламида) с помощью обычных инициаторных добавок под вакуумом в течение ночи. Он получил очень вязкую жидкость, содержащую длинные и спутанные нити линейного полиакриламида. Эту жидкость он смешивал в различных пропорциях с расплавленным 1%-ным раствором агара. При охлаждении смесей получались достаточно прочные гели, в которых жесткая и крупнопористая пространственная сетка агара была заполнена полужидким линейным полиакриламидом. Эта система обеспечивала такое же хорошее электрофоретическое разделение белков, как и нормальный ПААГ с тем же содержанием акриламида. Правда, нижний конец трубки при этом приходилось закрывать диализной пленкой во избежание вытекания геля . [c.149]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология