Концентрирующий гель

Буфер для приготовления концентрирующего геля — 0,5 М трис-НС1 буфер, содержащий 0,4%)-ный ДСН, pH 6,8. [c.121]

Сложную картину с большим числом полос наблюдают при электрофорезе препарата тяжелого меромиозина в присутствии додецилсульфата натрия. В этом случае представляет интерес сопоставить данные по электрофорезу препарата ТММ (тяжелого меромиозина) в диссоциирующих и в недиссоциирующих условиях. Нативный электрофорез в этом случае проводят в трис-глициновом буфере (pH 8,9) на пластинах с 5%-ным разделяющим гелем и 2,5—3%-ным концентрирующим гелем. В этом случае препарат тяжелого меромиозина дает в основном одну полосу, расположенную недалеко от старта, с м. м. 350 ООО Да. Это свидетельствует о том, что, несмотря на наличие многочисленных внутренних разрывов в полипептидных цепях, возникших в результате протеолиза, фрагменты цепей держатся вместе за счет нековалентного взаимодействия. При этом обеспечивается функциональная целостность структуры (сохранение АТФазной активности). [c.397]

Для разделяющего геля и нижней эл. тродной камеры (анода) используют разбавленный (см.ниже) буфер А. Для концентрирующего геля и образца применяют разбавленный буфер Б. Буфер В используют неразбавленным, и он предназначен для верхней электродной камеры (катода). [c.229]

При исследовании рибосомных белков методом двухстороннего электрофореза [654] авторы помещали пробу между двумя разделяющими гелями. Столбик геля приготавливали в следующей последовательности разделяющий гель -- концентрирующий гель — стартовый гель — концентрирующий гель — разделяющий гель. [c.101]

Этот раствор дегазируют в вакууме водоструйного насоса Раствор 4 Смешивают 2 ч. раствора 1 с 1 ч. раствора 2 и дегазируют Для приготовления раствора концентрирующего геля смешивают равные объемы растворов 3 и 4. На поверхность разделяющего геля пипеткой наносят 0,5-1-сантиметровый спой концентрирующего геля. Сверху наносят еще 1-санти-,метровый спой дегазированной воды и гель оставляют полимеризоваться в неподвижном вертикальном состоянии приблизительно на 20 мин, после чего слой воды удаляют. [c.230]

Рис, 44. Микроэлектрофорез в капиллярной трубке [914], 1 — электрод из платиновой проволоки 2 —стеклянная воронка —электродный буфер, pH 8,4 4 — резиновый колпа-чек 5 — буфер концентрирующего геля, pH 6,7 б — раствор белка (0,1 — 1 мкл) 7 —5%-ный концентрирующий гель, pH 6,7 5 —25%-ный разделяющий гель, pH 8,8. [c.109]

На стадии расфокусирования зоны переходят из концентрирующего геля в разделяющий. В разделяющем геле компоненты подвергаются просеиванию , и, следовательно, их подвижность уменьшается из-за более высокой концентрации акриламида. Это резко нарушает стационарные условия, которые определяют существование стопки зон при изотахофорезе. Разделяющий гель готовят в разделяющем буферном растворе (фаза гамма), который содержит компонент 3 и противоион 6, pH разделяющего геля должен отличаться от pH фазы бета (при миграции к аноду быть более высоким). По мере того как фаза бета мигрирует в разделяющий гель, создается новая фаза — ламбда. По мере перемещения движущейся границы (ламбда/гамма) компонент 1 фазы дзета вступает в разделяющий гель, его подвижность становится больше подвижности белков, и компонент 1 начинает двигаться впереди них. Таким образом, появляется новая фаза пи и новая движущаяся граница (пи/ламбда), через которую проходят все зоны белков. Они разделяются в соответствии с их индивидуальными скоростями, определяемыми величиной pH фазы пи, проводимостью и величиной приложенного напряжения. Высокому разрешению при таком разделении белков способствуют несколько факторов а) узкая стартовая зо- [c.122]

Пробы растворяют в буфере для концентрирующего геля, к которому добавлены 12,5% глицерина, 1,25% ДСН и 1,25% 2-меркаптоэтанола. До электрофореза их прогревают в течение 5 мин в кипящей водяной бане для того, чтобы прошла полная диссоциация и денатурация всех белков. В качестве красящей метки к пробам можно добавить бромфеноловый синий или феноловый красный. Окончательно приготовленные пробы должны содержать 1—5 мг/мл белка, причем в маленькие лунки (3X0,75 мм) достаточно вносить 5—25 мкг белка. Так как проводимость геля меняется по мере прохождения через него концентрирующего буфера, следует поддерживать постоянными напряжение или мощность, а не ток. [c.157]

Далее готовят разделяющий гель. Поверхность концентрирующего геля дважды быстро промывают смесью для получения разделяющего геля, а затем с помощью шприца заполняют трубку этой смесью так, чтобы получился выпуклый мениск, стараясь избежать образования пузырьков воздуха. Затем конец трубки плотно заклеивают полимерной пленкой. Всю эту процедуру необходимо провести в течение 5 мин после образования концентрирующего геля. Как только полимеризация закончится (через 30—40 мин), осторожно снимают колпачок, переворачивают трубку и аккуратно вставляют ее в резиновый колпачок нижним концом. Из другого конца, ставшего теперь верхним, удаляют раствор сахарозы и промывают поверхность концентрирующего геля смесью такого же состава. Затем наносят образец, включенный в смесь для приготовления стартового геля, и осторожно наливают электродный буфер до верхнего края трубки, не допуская перемешивания двух слоев. [c.263]

Разделяющие гели можно хранить в течение нескольких дней, но после добавления концентрирующего геля и исследуемого образца в стартовом геле электрофорез следует начать не позже, чем через 1 ч. Электродные буферы можно использовать многократно, но анодный и катодный буферы необходимо хранить отдельно. После нескольких анализов или при изменении pH приготавливают свежие буферные растворы. Гели анализируют либо непосредственно в трубках, либо после извлечения из них. [c.264]

Проба должна по возможности иметь такой же состав буфера, pH и ионную силу, как и концентрирующий гель. Следует избегать применения растворов с высокой ионной силой. [c.267]

Методика. Приготовление геля и электрофорез проводят в основном так, как описано выше в разделе, посвященном общим сведениям о гель-электрофорезе. Единственное различие состоит в том, что образец, разбавленный растворителем (см. ниже) в соотношении 1 1, осторожно наслаивают между концентрирующим гелем и буфером. После электрофореза фронт растворителя отмечают, вводя на этом уровне в столбик геля медную проволоку (№ 32). Гели окрашивают, как описано выше. Затем определяют значение для каждого геля и строят график зависимости lg/ m от концентрации геля (по меньшей мере для четырех концентраций). Наклоны полученных прямых для исследуемых и стандартных белков откладывают против молекулярной массы каждого из них (рис. 16.12,5). Молекулярную массу неизвестных белков определяют по калибровочному графику зависимости наклона — молекулярная масса. [c.271]

Методика. Разделяющий гель, содержащий ДСН, приготавливают так, как это описано выше для электрофореза в неоднородной ( прерывистой ) системе. Однако в данном случае концентрирующий гель не используется и образец наслаивают непосредственно на поверхность разделяющего геля. [c.273]

Для того чтобы предотвратить диффузию компонентов пробы вверх и тепловую конвекцию, было предложено [912] помещать над пробой еще один слой геля. Рекомендуется исследуемые вещества растворять в том же буфере, на котором приготовлен концентрирующий гель. Если образец сильно разведен, то для концентрирования белков путем изотахофореза [281] или методом скачка напряжения [570] требуется более толстый слой концентрирующего геля. В случае высокого исходного содержания солей в анализируемом препарате следует либо удалить их с помощью диализа, гель-фильтрации или каким-то другим способом, либо, если позволяет концентрация макромолекул, развести пробу. Для получения воспроизводимых результатов необходимо, чтобы во всех опытах наносимый раствор имел совершенно одинаковые ионную силу, pH и объем. [c.98]

Приготовление пробы. Обычно препаративный электрофорез в полиакриламидном геле не используют в качестве одного из начальных этапов в очистке белков и нуклеиновых кислот. Для предварительного грубого фракционирования компонентов омесей применяют методы хроматографии, высаливания или осаждения. Чтобы провести электрофоретическое разделение, пробу необходимо сконцентрировать до 5 мл для однородной системы и до 10—20 мл для неоднородной. От избытка солей можно избавиться при помощи диализа или гель-фильтрации. Концентрация солей в исследуемом растворе должна быть такой же, как в буфере концентрирующего геля. Если же этот гель не попользуется, то пробу диализуют против буфера разделяющего геля, разведенного в 5 раз. Медленное вхождение пробы в гель во время электрофореза свидетельствует о слишком высокой концентрации солей. Любой осадок, присутствующий в пробе, следует удалять центрифугированием или фильтрованием через миллипоровый фильтр, так как он может закупорить разделяющий гель. [c.117]

Перед электрофорезом белки, экстрагированные одним из указанных способов, необходимо подвергнуть диализу против раствора, содержащего мочевину и буфер концентрирующего геля или какой-либо сходный с ним буфер. В случае разрушения рибосом рибонуклеазами А или Тг [1299] этот этап можно исключить. [c.311]

Рис. 37, Диск-элсктрофо]1ез [942]. Л. Начало электрофореза. Б. Белки в концентрирующем геле. В, Белки в процессе разделения.

Диск-электрофорез сам по себе обеспечивает концентрирование образцов, происходящее в результате скачкообразных изменений pH и напряженности поля в концентрирующем геле. Это преимущество диск-электрофореза многие авторы использовали для исследования белков СМЖ без предварительного концентрирования образцов. Обычно для анализа вполне достаточно 0,4—0,7 мл жидкости [262], но в некоторых случаях можно наносить до 2 мл [1394]. При нанесении большого объема образца длина концентрирующего геля должна быть увеличена. [c.361]

Приготовление геля. Для полимеризации 30 мл разделяющего геля (12,5%) смешивают 12,5 мл раствора акриламида, 7,5 мл буфера разделяющего геля и 10 мл воды. После деаэрирования (5—10 мин на водоструйном насосе) к смеси добавляют 16 мг персульфата аммония и 18 мкл ТЕМЕД. Полученный раствор заливают либо в гелевую ячейку для вертикального электрофореза в пластине (с. 97), либо в трубки (с. 95). На поверхность раствора наслаивают воду. После полимеризации удаляют воду шприцом или фитилем из фильтровальной бумаги. Готовят смесь для концентрирующего геля. Смешивают 4 мл раствора № 1 с 5 мл буфера концентрирующего геля и добавляют [c.122]

Рис. 111. Корреляция между классами липопротеидов сыворотки, различаю шимися по плотности, и фракциями липопротеидов, полученными с помощью различных электрофоретических методов [769]. А. Электрофорез на бумаге, о. Электрофорез в агарозном геле. В. Электрофорез на ацетате целлюлозы. Л Электрофорез в полиакриламидном геле. — хиломикроны, ЛОЯЯ —липиды с очень низкой плотностью, ЛЯЯ —липиды с низкой плотностью, ЛВП— липиды с высокой плотностью, / — стартовый гель, 2—концентрирующий гель, 3 — разделяющий гель.

Разделение полинуклеотидов в геле основано на различиях в размере, форме и подвижности. Выделение тРНК из суммарного экстракта РНК нужно проводить в таком геле, который препятствует движению высокомолекулярных РНК. Поэтому применяют стандартную методику Ричардса и сорт. Ri hards et ai,,, 1965), в которой используют ступенчатую буферную систему с 5%-ным концентрирующим гелем и 10%-ным разделяющим гелем, модифицированную таким образом, чтобы создать pH 8,2, а не 8,9. [c.228]

Данные, полученные Лабри (Labrie, 1969), указывают на то, что для очистки гемоглобиновой мРНК более всего подходит 3-4%-ная концентрация полиакриламидного геля. При такой низкой концентрации геля можно использовать преимущества ступенчатой буферной системы, применяя в качестве концентрирующего геля разбавленный агарозный гель или же достаточно концентрированный раствор сахарозы. Последующие указания даны для 3,3%-ного разделяющего и 1%-ного агарозного концентрирующего гелей. [c.254]

Эту смесь дегазируют (раствор 4), смешивают с равным объемом раствора 3, заполняют трубки для электрофореза и дают гелю застыть. Затем готовят концентрирующий гель при кипячении с обратным холодильником 1%-ной суспензии агарозы в буфере Б, разбавленном в восемь раз. После 15-минутного кипячения раствор агарозы охлаждают до 45 С и наслаивают 0,5-сантиметровым споем на сухую поверхность полиакриламидного геля. Трубки выдерживают при комнатной температуре до застывания геля, мРНК растворяют в 0,1 мл раствора, содержашего 10% сахарозы и 0,2% бромфенолового синего в буфере Б, разбавленном в восемь раз. Образец помещают на поверхность концентрирующего геля и проводят электрофорез, как описано выше. мРИК локализуют и экстрагируют, как описано для тРНК, [c.255]

М трис-буфере, доведенном НС1 до pH 8.8. Полимеризация инициируется удалением воздуха из раствора и добавлением тетраметилэтилендиамина (до 0,8%) и персульфата аммония (до 0,015%). Пока не произойдет полимеризация, разделяющий гель держат под слоем воды. Воду выливают и наслаивают концентрирующий гель, или гель для нанесения, содержащий 4,5% акриламида, 0,12% бисакриламида и 0,1% ДСН в 0,125 М трис-буфере, доведенном НС1 до pH 6,8. Этот гель по-лимеризуется добавлением тетраметилэтилендиамина (до 0,125%) и персульфата аммония (до 0,05%). Перед полимеризацией, чтобы сформировать лунки для проб, в концентрирующий гель вставляют тефлоновую (фторопластовую) гребенку. После полимеризации образовавшиеся лунки промывают несколько раз электродным буфером, содержащим небольшое количество бромфено-лового синего. При этом удаляется непрореагировавший персульфат, а границы лунок слегка окрашиваются, так что их можно видеть при нанесении проб. Верхний электродный буфер содержит 0,182 М глицин, 0,0255 М трис (конечное значение pH 8,3) и 0,1% ДСН. Нижний электродный буфер содержит те же компоненты, за исключением ДСН. [c.157]

Электрофорез проводят либо в цилиндрических колонках, заполненных гелем (в стеклянных трубках), либо на пластинках размерами 10ХЮ см, покрытых слоем геля толщиной 1—4 мм. Гель состоит из трех слоев внизу располагается разделяющий гель, в середине — концентрирующий (гель-прокладка) и вверху — стартовый гель, содержащий образец. Каждый слой представляет собой полиакриламид с определенной степенью сшивки. Гель образуется в трубке или на пластинке из раствора, содержащего акриламид (мономер), М,М -ме-тиленбисакриламид (БИС), буфер, сшивающий и поли-меризующий агенты. Полимеризацию катализируют либо химическим способом, используя персульфат аммония, либо фотохимическим — с помощью света, который вызывает образование свободных радикалов в присутствии кислорода. [c.259]

Первоначальная процедура заполнения трубок ак-риламидом, описанная Орнстейном [67] и Дэвисом [64], начиналась с полимеризации разделяющего геля в нижней части трубки. Позже была предложена методика [66], по которой разделяющий гель полимеризуется в верхней части трубки, так как при этом образуется более однородная граница раздела между концентрирующим и разделяющим гелями. Заполнение трубки проводят следующим образом. В резиновый колпачок наливают 0,2 мл 40%-ного раствора сахарозы и плотно прижимают трубку к дну колпачка, для того чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха. Трубку устанавливают в вертикальное положение затем готовят около 0,15 мл смеси для получения концентрирую -щего геля (см. ниже) и с помощью небольшого шприца с иглой (длина 8 см, внутренний диаметр 0,6—0,8 мм) наслаивают эту смесь на раствор сахарозы. На поверхность концентрирующего геля осторожно наливают немного воды так, чтобы не произошло перемешивания этих двух слоев и между ними образовалась резкая граница. Высокое разрешение достигается в основном благодаря образованию четкой ровной границы между [c.262]

С поверхности заполимеризовавшегося концентрирующего геля удалить воду и внести образец (смесь изоферментов ЛДГ, разведенную 40 %-ным раствором сахарозы в отношении 1 1) в количестве 0,2 мл. Наслоить раствор лидирующего красителя (0,001 %-ный раствор бромфенолового синего). Эта часть колонки непосредственно соприкасается с электродным буфером при электрофорезе, поэтому верхнее наслаивание заканчивается электродным буфером. Наслаивание проводят очень осторожно, избегая перемешивания образца с буфером, во избежание потери вещества. [c.272]

Для получения раствора разделяющего геля смешивают его компоненты. Перед добавлением персульфата из раствора удаляют под вакуумом воздух, так как, во-первых, даже следы молекулярного кислорода подавляют щроцесс полимеризации и, во-вторых, в результате образования тепла во время электрофореза другие газы, присутствующие в геле, выделяются в виде пузырьков и искажают условия проведения опыта. После добавления персульфата раствор геля заливают в трубки до высоты около 50 мм и сверху аккуратно наслаивают воду, которая препятствует образованию мениска, т. е. искривлению поверхности геля, и одновременно мешает доступу атмосферного кислорода, тормозящего полимеризацию. Для устранения влияния кислорода гель даже помещают в атмосферу азота [1310]. Полимеризация обычно начинается примерно через 20 мин и заканчивается через 45 мин. После этого воду с поверхности геля тщательно отсасывают при помощи шприца с иголкой или пипетки, а остатки воды удаляют фитильком из фильтровальной бумаги илп целлюлоз но-ацетатной пленки. Далее поверхность разделяющего геля ополаскивают небольшим количествам раствора концентрирующего геля, который наливают затем в трубку на высоту 10 мм и сверху вновь аккуратно покрывают водой. Трубки облучают флуоресцентной лампой дневного света или просто выставляют на солнечный свет на 20—30 мин в таких условиях, чтобы он не нагревались. Полимеризация начинается примерно через 5 мин после начала облучения (в зависимости от его интенсив ности), [c.96]

Побочные продукты полимеризации, непрореагировавшие мономеры [230], а также персульфат могут взаимодействовать с исследуемыми веществами и приводить к искажению картины электрофореза. Особенно часто причиной артефактов служит персульфат [168, 678, 877]. Для удаления этих веществ пз геля рекомендуется либо проводить предварительный электрофорез (преэлектрофорез) до нанесения пробы [569, 799, 962, 1000], либо промывать гель буферным раствором [777, 778]. Бремер [168] попытался использовать для полимеризации разделяющего геля рибофлавин вместо персульфата, однако это привело к ухудшению разделения веществ и воспроизводимости результатов, причем полосы белка стали менее четкими [678]. Для защиты компонентов пробы от окисления персульфатом можно воспользоваться антиоксидантами (дитиотреитолом или 2-мер-каптоэтанолом), но необходимо учитывать, что эти вещества снижают скорость полимеризации акриламида, а при высоких концентрациях и вовсе препятствуют ей. Для преодоления этого нежелательного явления следует проводить полимеризацию при 37 °С, а не при комнатной температуре [798]. Нужно отметить, что персульфат, обладающий высоким удельным зарядом, движется в анионной системе впереди любого белка и, если применяется концентрирующий гель, никогда непосредственно не соприкасается с белками. Поэтому было высказано пред- [c.98]

Если изучаемые белки имеют заряды разных з наков, то при использовании описанного Выше прибора для диск-электрофореза часть макромолекул во время опыта будет потеряна. Для предотвращения таких потерь и выявления белков, движущихся вверх, Клар к [236] рекомендовал помещать над исследуемой. пробой еще один разделяющий гель высотой 2 см. Позднее Ра кусен [1047] модифицировал этот метод, соединив при помощи пластмассовой вставки две трубки, в каждой из которых находился разделяющий гель в желаемом буфере. В пространство между трубками вводили 1 мл раствора концентрирующего геля, содержавшего пробу, и подвергали его фотополимеризации. [c.101]

Концентрирующий гель можно с успехом использовать в препаративной колонке (для которой иногда требуются большие количества геля), чтобы устранить нежелательные эффекты, вызванные наличием солей и отсутствием преэлектрофоре-за [1184]. Концентрация этого геля должна быть такой, чтобы белки до. вхождения в разделяющий гель подверглись предварительному фракционированию в соответствии с размерами их молекул. Подобным способом можно предотвратить закупоривание разделяющего геля концентрированным раствором белков. Если же исследуемая проба очень разбавлена, то рекомендуется применить более разведенный концентрирующий гель,, не обладающий свойствами молекулярного сита. Это даст возможность сконцентрировать белковые компоненты ири помощи изотахофореза. Таиим образом, концентрирующий гель играет довольно существенную роль при препаративном электрофорезе в полиакриламидном геле. [c.115]

Электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН по методу Леммли [732]. Пробы, содержащие 62,5 мМ буфер трис-НС1 (pH 6,8), 2 /о ДСН, 10% глицерина, 5% 2-меркаптоэтанола и 0,001% бромфенолового синего, погружают на 1,5 мин в кипящую воду, Концентрирующий гель 3,08% Т, 2,6% С 125 мМ трис-НС1 (pH 6,8) 0,1% ДСН 0,025% ТЕМЭД 0,025% персульфата аммония. Разделяющий гель 8,22%, Т и 2,6% С или 10,36% Т и 2,6% С 0,375 М буфер трис-НС1 (pH 8,8) 0,1% ДСН, 0,025% ТЕМЭД, 0,025% персульфат аммония. Электродный буфер 0,025М трис —0,0192 М глицин (pH 8,3) 0,1% ДСН. [c.226]

Невил [921] использовал неоднородную буферную систему. Разделяющий гель 7,2% Т, 2,77% С, 0,58 М уксусная кислота, 7,5 мМ КОН (pH 2,7), 9 М мочевина, 0,0004% рибофлавина, 0,05% персульфата аммония, 0,08% ТЕМЭД. Концентрирующий гель 1,95% Т, 11,4% С, 0,065 М уксусная кислота, 0,06 М КОН (pH 5,9), 7 М мочевина, 0,0004% рибофлавина, 0,05% персульфата аммония. Верхний электродный буфер 0,11 М глицин, 0,016 М уксусная кислота (pH 4,0), 6 М мочевина. Нижний электродный буфер 4,6 М уксусная кислота, 0,06 М КОН (pH 2,7). Образцы содержали 8 М мочевину, 0,05 М К2СО3, 10% 2-меркаптоэтанола и следы метилового зеленого. [c.317]

Из-за сложности манипулирования с мягкими гелями большинство исследователей предпочитает окрашивать липопротеиды перед электрофорезом (предварительное окрашивание). С этой целью краситель включают в стартовый гель или смешивают с образцом и перед электрофорезом центрифугируют [1066, 1445]. Недостаток методов предварительного окрашивания состоит в том, что они не позволяют достаточно надежно определять хиломикроны. Стартовый гель может окрашиваться избытком красителя, не связанного с липопротеидами, в результате чего создается ложное впечатление присутствия на электрофореграмме хиломикронов [373, 1445]. Чтобы облегчить визуальное обнаружение хиломикронов, Наито и др. [899] рекомендуют использовать для предварительного окрашивания разбавленный раствор суданового черного в этиленгликоле и одновременно снижать концентрацию рибофлавина в стартовом и концентрирующем гелях. Маскет и др. [830] предотвратили появление ложных зон хиломикронов, применив раствор суда-нового черного В в водном растворе диэтиленгликоля. Для поддержания красителя в растворенном состоянии они добавляли небольшое количество твина 20. Новый подход к предваритель- [c.358]

Чаще белок гидролизуют в зоне полиакриламида раствор фермента (оптимально —10 мкл) помещают в соответствующую лунку, которая уже содержит электродный буфер. Раствор фермента по составу должен быть аналогичным тому, в котором находится концентрирующий гель, но иметь несколько большую плотность, для чего добавляют 10—207о глицерина или сахарозы. Кусочек геля, содержащий белок-субстрат, осторожно опускают в лупку над раствором протеазы так, чтобы не нарушить компактность слоя. Полезно для приготовления второго [c.228]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология