Полиакриламидно-агарозные гели

Разрешающая способность электрофореза в комбинированных полиакриламидно-агарозных гелях повышается при включении, в гель 6 М мочевины [389]. В этом случае можно выявить молекулы, различающиеся по размерам всего на 5%. [c.382]

Нейман и Хенри i[910] для экстрагирования нуклеиновых кислот, разделенных в полиакриламидно-агарозном геле, применяли фенол. Измельченные участки геля суспендировали в [c.386]

Обычная анионообменная хроматография оказалась непригодной для очистки РНК, содержащих более 100—150 нуклеотидных остатков. Поэтому рибосомальные и матричные РНК обычно разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном или агарозном геле. К достоинствам этого метода относится высокая скорость процесса и высокая разрешающая способность по отношению к одноцепочечным молекулам, различающимся по своим размерам. Аффинная хроматография основана на том, что высокая степень специфичности может быть достигнута за счет гибридизации или химических взаимодействий между молекулами РНК, находящимися в растворе, и соответствующими соединениями, ковалентно связанными с твердым носителем. [c.176]

Молекулярно-ситовая хроматография. При данном виде хроматографии используется способность материалов с контролируемой пористостью сортировать и разделять компоненты смеси в соответствии с размерами и формой их молекул. Для осуществления процесса гель-хроматографии используются гели поперечно-емкостного декстрана (сефадексы и сефакрилы), поперечно-сшитые полиакриламидные гранулы (биогели), агарозные гели с выраженными в них цепями акриламидного полимера (ультрагели) и более жесткие поперечно-сшитые агарозы (СЬ-агарозы и сефакрилы-8), с помощью которых можно быстро разделить макромолекулы в соответствии с их размером. Степень удерживания растворенного вещества на колонке зависит от его способности проникать в поры геля. Поэтому при гель-фильтрации сначала выходят высокомолекулярные вещества, а затем вешества в порядке убывания их моле- [c.55]

На рис. 9 изображен прибор для зонального электрофореза в градиенте плотности [985]. Основной его частью является J-образная трубка, основание которой заполнено пробкой из полиакриламидного геля. В коротком колене трубки над пробкой геля находится насыщенный раствор хлористого натрия, в который погружен один из электродов. В длинном колене поверх трубки помещают слой забуференного насыщенного раствора сахарозы, а остальную часть этого колена используют как градиентную колонку. Для ее заполнения и опорожнения служит поршень, соединенный с градиентным смесителем или коллектором фракций при помощи гибкого пластмассового шланга. Кроме того, в поршне просверлены отверстия, которые заполняют забуференным полиакриламидным или агарозным гелем для обеспечения электрического контакта с на- [c.30]

Для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот применяют также неоднородные буферные системы [387, 1087]. При электрофорезе в комбинированном полиакриламидно-агарозном геле применяли трис-боратный буфер [983]. Электрофоретические свойства нуклеиновых кислот, а значит, и их разрешение при электрофорезе в какой-то степени зависят от используемой буферной системы [778, 1004, 1070]. По нашему мнению, в каждом конкретном случае наиболее подходящий буфер [c.372]

Электрофорез нуклеиновых кислот в полиакриламидно-агарозных гелях [c.380]

Анализ гидрофильных полимеров и биополимеров осуществляют на мягких и жестких гидрофильных сорбентах, таких как сефадексы, полиакриламидные и агарозные гели, макропористые силикагели и макропористые стекла. [c.82]

Декстрановые гели (сефадексы), полиакриламидные гели (биогель Р), агарозные гели (сефарозы, биогель А), агар, пористые стекла [c.68]

При гель-электрофорезе РНК в качестве денатурирующего агента обычно используют мочевину. РНК и ее фрагменты, в состав которых входит от 12 до 150 нуклеотидных звеньев, можно разделить в высокопроцентных полиакриламидных гелях, содержащих 7 М мочевину [85], а более длинные РНК (состоящие из 1500—4500 нуклеотидных звеньев)—в низкопроцентных полиакриламидных или агарозных гелях, содержащих 6 М мочевину [86, 87]. [c.179]

Гель-электрофорез использовали для изучения нуклеотидной последовательности ДНК генома до тех пор, пока не были открыты рестриктазы. К настоящему времени выделены сотни таких ферментов, каждый из которых узнает специфическую нуклеотидную последовательность длиной от 2 до 8 пар оснований и расщепляет двухцепочечную молекулу ДНК лишь в этом участке [108]. Точки расщепления обеих цепей ДНК могут находиться либо на одинаковом расстоянии от одного из концов молекулы (т. е. располагаться строго напротив друг друга), либо быть смещены относительно друг друга на несколько звеньев. В первом случае образуются фрагменты с тупыми концами, содержащие только спаренные нуклеотидные остатки, а во втором — с липкими , которые представляют собой небольшие участки одноцепочечной ДНК. Используя рестриктазы различной специфичности, можно расщепить высокомолекулярную ДНК на отдельные фрагменты, размеры большинства из которых находятся в диапазоне, приемлемом для разделения этих фрагментов с помощью электрофореза в полиакриламидном или агарозном геле [107]. Таким способом были получены уникальные фрагменты ДНК генома, которые затем были встроены в рекомбинантные ДНК-векторы [109]. Этот раздел посвящен разделению таких фрагментов. [c.184]

ПОЛИАКРИЛАМИДНО-АГАРОЗНЫЕ СОСТАВНЫЕ ГЕЛИ [c.90]

По окончании электрофореза рекомендуется как можно быстрее провести фиксацию разделенных веществ путем их осаждения или высушивания, так как диффузия молекул продолжается и после отключения электрического тока, что приводит к ухудшению картины разделения. Бумагу и пленки из ацетата целлюлозы обычно высушивают, в случае же крахмального и полиакриламидного геля применяют осаждение разделенных веществ. Следует заметить, что пластины агарового и агарозного гелей, а также тонкие слои полиакриламидного геля тоже можно высушивать, но это, как правило, занимает много времени и, следовательно, нецелесообразно. [c.186]

После электрофореза поддерживающую среду часто приходит-ся разделять на фрагменты для определения в них ферментативной или антигенной активности, либо радиоактивности. Полоски бумаги или ацетата целлюлозы и пленки высушенного агара можно легко разрезать ножницами или бритвой. Разрезание крахмального геля на продольные блоки относится к обычным процедурам, применяемым при электрофорезе в этом геле. Чтобы выделить разделенные компоненты из крахмального или агарового геля, его чаще всего разрезают бритвой в поперечном направлении. Описан способ фракционирования разбавленного) (0,05—0,1%) агарозного геля путем его расплавления при 80 и последующего сбора капель с помощью коллектора фракций [546]. Что же касается полиакриламидного геля, обладающего [c.201]

Несмотря на высокую разрешающую способность, электро форез в гелях со свойствами молекулярного сита не нашел ши рокого применения в повседневной клинической практике. Он более трудоемок, чем электрофорез на ацетате целлюлозы или в агарозном геле. К тому же электрофорез в крахмальном или полиакриламидном геле труднее проводить в стандартных условиях. Проблемы стандартизации условий электрофореза в полиакриламидном геле подробно обсуждаются Маурером и Алленом [841]. Разумеется, необходимо сопоставлять стоимость метода с ценностью получаемой с его помощью информации. Основная причина того, что в повседневной практике до сих пор широко используются электрофоретические методы, обладающие ограниченной разрешающей способностью, заключается в следующем пока известна физиологическая роль лишь небольшого числа белков плазмы и те фракции, которые нельзя обнаружить простыми методами, дают мало полезной информации для диагноза. Методы электрофореза с высокой разрешающей способностью имеют исключительно важное значение в исследованиях белков плазмы, и после установления природы и физиологической роли остальных белковых компонентов эти методы, несомненно, займут свое место в клинической практике. [c.333]

К гидрофильным мягким гелям относятся сефадексы, или декст-рановыегели, имеющие мостики типа —О—СН2СН(ОН)СН2—О—, агарозные гели, обладающие водородными мостиками, связывающими цепи агарозы, полиакриламидные гели и крахмал. [c.230]

Скуде и Джеппсон [1191] в первом направлении проводили ИЭФ в полиакриламидном геле, а антитела включали в комбинированный полиакриламидно-агарозный гель (2% полиакриламида и 0,5% агарозы), вполне пригодный для иммунопреципитации. Во время электрофореза во втором направлении необходимо было накрывать гель тонкой полимерной пленкой, чтобы предотвратить сокращение объема полиакриламидного геля. Джонсон и др. [643] проводили электрофорез в первом направлении в комбинированном геле (5% полиакриламида и 0,8% агарозы), а во втором — в агарозном геле, содержащем антитела. [c.261]

Чига и др. [225] предложили проводить электрофорез сывороточных белков в гелях, содержащих ДСН. Они применили полиакриламидно-агарозный гель [984] в 0,1 М фосфатном буфере, содержавшем 0,1% ДСН. В этих условиях белки сыворотки делились на 6 четких зон. Метод может быть использован для сравнительных исследований распределения белков по [c.334]

Пикок и Дингман [983] использовали в качестве красителя метиленовый синий, растворенный в ацетатном буфере (pH 4,7) в конечной концентрации 0,2%. После электрофореза комбинированные полиакриламидно-агарозные гели вымачивали 10— 15 мин в растворе уксусной кислоты и затем окрашивали. Обесцвечивание гелей проводили путем их промывания в нескольких сменах воды или проточной водой. На этом этапе следует проявлять осторожность, так как при длительном обесцвечивании краситель вымывается и из зон нуклеиновых кислот. Гели, окрашенные метиленовым синим, можно хранить в течение нескольких месяцев в герметичной упаковке из полиэтилентере-фталатной пленки saran wrap [1232]. [c.384]

Описаны методы, позволяющие разделять РНК в количестве от 5-10 ° до 1 10 г на пластинах геля размером 30X4X0,1 мм. Для разделения низкомолекулярных РНК был использован полиакриламидный гель [335], а для разделения рибосомных РНК—комбинированный полиакриламидно-агарозный гель [1099]. Разделенные зоны окрашивали акридиновым оранжевым или фотографировали в ультрафиолетовом микроскопе при 100-кратном общем увеличении. Метод обладает такой же высокой разрешающей способностью, как и обычный электрофорез нормального масштаба. [c.388]

Для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот среднего размера обычно применяют агарозные гели. Агароза — это особо чистая фракция, получаемая из агара или непосредственно из агарообразующих морских водорослей. В 1,0% агарозном геле можно разделять молекулы ДНК размером от 600 до 20 ООО п. н. Для фракционирования более крупных молекул ДНК (миллионы пар оснований), денатурированной ДНК и РНК приходится использовать специальные системы электрофореза. Иногда для решения специальных задач для разделения ДНК применяют полиакриламидные гели. Так, в 20% полиакриламидном геле можно разделить фрагменты ДНК, состоящие всего из шести оснований и различающиеся лишь одним нуклеотидом. [c.54]

Рис. 111. Корреляция между классами липопротеидов сыворотки, различаю шимися по плотности, и фракциями липопротеидов, полученными с помощью различных электрофоретических методов [769]. А. Электрофорез на бумаге, о. Электрофорез в агарозном геле. В. Электрофорез на ацетате целлюлозы. Л Электрофорез в полиакриламидном геле. — хиломикроны, ЛОЯЯ —липиды с очень низкой плотностью, ЛЯЯ —липиды с низкой плотностью, ЛВП— липиды с высокой плотностью, / — стартовый гель, 2—концентрирующий гель, 3 — разделяющий гель.

Основное практическое значение имеет электрофорез в гелях гель-электрофорез). При использовании гелей практически исчезает опасность конвекции, резко уменьшается коэффициент диффузии и размывание зон незначительно. В результате на одном геле длиной около метра можно получить до сотни или даже более зон. Наиболее широко используется электрофорез в сшитых полиакриламидных и агарозных гелях. Агароза является компонентом агар-агара, содержащегося в красных морских водорослях. Она построена из чередующихся остатков В-галак-тозы и 3,6-ангидро-1/-галактозы, связанных попеременно 0 —> 4)- и а(1 3)-связями [c.242]

Агаровые гели вследствие гораздо меньшей эффективности при разделении шотребляют гораздо реже, чем агарозные или полиакриламидные. Разделение 16 S и 23 S (или 18S и 28 S ) рРНК было проведено в полиакриламидном геле с концентрацией 2-2,6% и в агарозном геле с концентрацией 2-3%. Несмотря на то что разрешение [c.247]

S и 23S РНК в полиакриламидном геле лучше, чем в агарозном, однако он слишком текуч и труден для раг-боты. Этот недостаток можно устранить, добавив к 2%-ному полиакриламидному гелю 0,5°6-ный агарозный гель ( Pea o k, Dingman, 1968). Смешанный гель такого типа сравним по твердости с полиакриламидным гелем большей концентрации, и его можно легко разрезать для локализации и выделения радиоактивной РНК, [c.247]

Данные, полученные Лабри (Labrie, 1969), указывают на то, что для очистки гемоглобиновой мРНК более всего подходит 3-4%-ная концентрация полиакриламидного геля. При такой низкой концентрации геля можно использовать преимущества ступенчатой буферной системы, применяя в качестве концентрирующего геля разбавленный агарозный гель или же достаточно концентрированный раствор сахарозы. Последующие указания даны для 3,3%-ного разделяющего и 1%-ного агарозного концентрирующего гелей. [c.254]

Теория и методология гель-хроматографии подробно обсуждается в ряде обзоров и книг Г1—9]. Этот метод позволяет разделять белки в соответствии с размерами их молекул. Первыми с колонки элюнруются самые большие молекулы, в то время как молекулы меньшего размера, способные диффундировать в поры матрицы, заполненные жидкой фазой, удерживаются на колонке. Размер пор матрицы геля определяет диапазон молекулярных масс макромолекул, способных проникать в частицы геля и выходить из них. Для фракционирования белков пригодны различные полиакриламидные, агарозные и декстрановые гели. [c.106]

При хроматографии полисахаридов и высших олигосахаридов предпочтительным является использование элюентов с высокой ионной силой для предотвращения ассоциации молекул хроматографируемых веществ и их взаимодействия с сорбентом. Данный прием приобретает особое значение в анализе молекулярно-массового распределения, при проведении которого рекомендуется в качестве элюента 0,3%-ный [124] или 0,9%-ный раствор Na I [125]. Однако наиболее широкое применение для этой цели находит 1М Na I [132, 170—173], использование которого для элюирования колонок с полиакриламидными и агарозными гелями обычно обеспечивает достаточную воспроизводимость хро.матографических данных. Полученные таким образом результаты можно использовать при анализе олигосахаридов, образующихся при избирательном расщеплении изучаемых полисахаридов [171—173]. [c.33]

Электрофоретическая подвижность двухцепочечных ДНК в полиакриламидном или агарозном геле пропорциональна логарифму их молекулярной массы [107]. По вышеизложенным причинам это соотношение справедливо лишь в случае фрагментов со сравнительно низкой молекулярной массой. Для электрофореза обычно используют трис-буфер с низкой ионной силой, доведенный до pH 7—8 путем добавления NaH2P04, борной или уксусной кислоты [107]. Выбор геля определяется размерами фрагментов, которые необходимо разделить. Электрофоретическое разделение фрагментов, содержащих менее 400 пар нуклеотидов, проводят в 2—10%-ных полиакриламидных гелях, фрагменты длиной в 400—1000 пар нуклеотидов разделяют в комбинированных полиакриламид-агарозных гелях, а более длинные фрагменты —в 0,5—1,0%-ных агарозных гелях [107]. Соединения, существенно различающиеся по молекулярной массе, можно разделить в градиенте концентрации полиакриламидного геля [106]. [c.184]

В ядрах клеток всех эукариотов ДНК присутствуют в виде ассоциатов с гистоновыми белками. Эти ассоциаты, или хрома-тиновые фибриллы, представляют собой надмолекулярную структуру, повторяющимся элементом которой является частица, называемая нуклеосомой. Каждая нуклеосома состоит из восьми гистонов (по две молекулы гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4) и включает участок намотанной на этот белковый октамер нити ДНК длиной в 140 нуклеотидных пар. Продолжение этой нити образует перемычку со следующей нуклеосомой. В зависимости от т ого, какому организму или какой ткани этого организма принадлежит данная клетка, перемычка между нуклео-сомами может содержать от О (дрожжи) до 100 (сперма морского ежа) нуклеотидных пар. Стафилококковая нуклеаза расщепляет молекулу ДНК в области перемычек с образованием фрагментов, длина которых кратна длине участка ДНК, входящего в состав нуклеосомы [136]. После отделения от белков эти фрагменты можно разделить с помощью электрофореза в агарозном геле и таким образом обнаружить различия в структуре повторяющегося звена хроматина (рис. 10.13, Л). При обработке хроматина ДНКазой I нуклеосомальная ДНК расщепляется на фрагменты, содержащие в среднем 10,4 нуклеотидных пар (я —целое число) [137]. Эти сравнительно более короткие фрагменты ДНК можно разделить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (рис. 10.13, ). [c.193]

Электрофорез в агаровом или агарозном гелях можно проводить также в маленьких стеклянных трубочках аналогично диок-электрофорезу в полиакриламидных гелях. Чтобы при этом гели не вьгскальзывали из трубоч1ек, нижнюю часть их закрывают нейлоновой сеткой [286, 533, 534]. [c.63]

С тех пор как полиакриламидно-агарозные составные гели были предложены [984, 1324] в качестве поддерживающей среды при исследовании полимеров с очень высокой молекулярной массой, эти гели часто используются при изучении нуклеиновых кислот и нуклеопротеидных частиц. Разделение в них также зависит от размеров н заряда макромолекул. При этом агароза лишь улучшает механические свойства разбавленного полиакриламидного геля и не влияет существенно на свойственный ему эффект молекулярного сита. [c.90]

При измерении радиоактивности в жидкостном сцинтилля-ционном спектрометре тщательно высушенные полоски бумаги или ацетата целлюлозы помещают непосредственно в раствор жидкого сцинтиллятора, так как эти материалы либо прозрачны, либо растворимы в таких жидкостях 255]. Некоторые авторы измеряют радиоактивность в агарозном [1269] или полиакриламидном [1376] геле без предварительной обработки их жидким сцинтиллятор,ом. По другой методике [1249] кусочки крахмального геля сначала гомогенизируют в 0,4 мл триметил-аммонийгидроксида, а затем полученный гомогенат смешивают с 10 мл раствора Брэя [166], содержащего 5%-ный кабосил (фирма abot, США), и измеряют радиоактивность. К сожалению, указанные методы довольно малочувствительны [470]. [c.207]

Если для разделения белков в первом направлении прибегают к изоэлектрофокусированию (перекрестное иммуноэлектрофокусирование), то возникает ряд проблем. Агароза является мало подходящей средой для ИЭФ, поскольку этот метод требует среды, в которой отсутствует электроосмос (см. разд. 1.12.2). Можно, конечно, использовать для ИЭФ полиакриламидный гель, а разделение во втором направлении проводить в агарозном геле, содержащем антитела. Однако, как будет видно из дальнейшего изложения, применение разных сред также имеет ряд недостатков. Один из возможных путей решения этой проблемы заключается в приготовлении агарозы, из которой получается гель почти с нулевым зарядом (см. разд. 1.9.2). В этом случае весь анализ (изоэлектрофокусирование и последующий электрофорез в геле, содержащем антитела) можно проводить в агарозном геле. Таким способом осуществляли перекрестное иммуноэлектрофокусирование Йохансон и йертен [631], а также Вейс и др. [1392]. Первые авторы проводили электрофорез во втором направлении при pH 8,2—8,6, так как в применяемой ими среде подвижность антител при этом pH была близка к нулю. [c.255]

Кичин и др. [681, 682] применяли вертикальный электрофорез в пластинах 5%-ного полиакриламидного геля в буфере трис-борат-ЭДТА (pH 8,2). Полученная картина была аналогична той, которую дает вертикальный электрофорез в крахмальном геле. В обоих случаях было выявлено несколько вариантов фенотипов. Дальнейшее уточнение фенотипов группоспецифических веществ было достигнуто с помощью перекрестного иммуноэлектрофореза [239]. Белки, разделенные путем электрофореза в полиакриламидном геле, подвергали затем электрофорезу в агарозном геле, содержавшем антитела к труппоспецифическим веществам. [c.340]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология