Флуоресцентный сортер FAS

Анализ на флуоресцентном сортере [c.177]

Выделение клеток с флуоресцентными активированными клеточными сортерами (ФАКС) требует дорогостоящего оборудования и малопригодно для рутинных экспериментов, особенно при необходимости получения большого числа клеток. Следовательно, существует необходимость в более широко доступных и воспроизводимых методах разделения клеток. Аффинная хроматография в принципе представляет собой идеальный метод для очистки клеток он заключается в иммобилизации на твердых носителях лигандов, избирательно узнающих компоненты мембран. [c.243]

Кроме того, с помощью иммунофлуоресцентных тестов можно идентифицировать отдельные клетки в клеточной суспензии, т. е. выявлять антигены на поверхности живых клеток. Для этой цели суспензию живых клеток, флуоресцентно окрашенных специфичными реагентами, пропускают через проточный флуоресцентный клеточный сортер - прибор, измеряющий интенсивность свечения каждой клетки в разных областях спектра и затем разделяющий клетки по параметрам свечения. Данный метод позволяет выделять различные клеточные популяции, т. е. разделять клетки, несущие специфические поверхностные антигены и соответственно этому окрашенные различными флуоресцентно меченными антителами (рис. 29.9). В гл. 13 приведены данные о том, как используется этот метод для определения субпопуляций развивающихся тимоцитов (см. рис. 13.19). [c.530]

Проточный флуоресцентный клеточный сортер [c.533]

Флуоресцентный клеточный сортер. Прибор для анализа клеток методом проточной цитометрии, позволяющий разделять их по определенным признакам и выделять различные клеточные популяции. [c.563]

Известно, что компетентные клетки способны включать-большое количество донорной ДНК, причем одна реципиентная клетка может включать несколько разных молекул донорной ДНК в один геномный сайт. Этот феномен позволяет выделять компетентные субпопуляции из общей массы реципиентных клеток и маркировать геном млекопитающих. Если донорная ДНК смешана с плазмидной, кодирующей селективный для клеток млекопитающих маркер, селекция по плазмидному гену после трансфекции позволяет выделить популяцию трансфицированных клеток. Такое обогащение облегчает дальнейшую очистку реципиентных клеток. Этот прием оказался успешным при клонировании генов, кодирующих клеточные поверхностные антигены. В данном случае для обогащения использовали антитела, а для разделения субпопуляций клеток флуоресцентный сортер (FA S) [46]. [c.28]

Как уже упоминалось, каждая антигенная система требует своего особого метода накопления соответствующих В-клеток. Метод накопления нужных В-клеток с помощью розетирования мы уже обсуждали в связи с получением МКА к антигену RhD. Данный метод вполне пригоден и для получения МКА к другим групповым антигенам крови. Для получения МКА к столбнячному анатоксину был описан другой прием использовали антиген, конъюгированный с флуоресцеином, и затем выделяли связавшие метку клетки с помощью флуоресцентного сортера [16]. Если возникнет необходимость, у исследователей хватит изобретательности, чтобы разработать способ выделения В-клеток, специфичных к любой антигенной детерминанте. [c.163]

В одной из схем В-лимфоциты человека, активно продуцирующие специфические антитела, обработали флуоресцентно меченным антигеном, затем с помощью клеточного сортера провели обогащение образца В-лимфоцитами, вырабатывающими эти антитела. Поскольку В-клетки плохо растут в культуре, для улучшения роста их трансформировали вирусом Эпштейна-Барр. Некоторые клоны трансформированных В-кле- [c.214]

Флуорохромы можно присоединять непосредственно к моноклональным антителам, или, как это делается чаще всего, можно пометить вторичный реагент для непрямого выявления антител, такой, например, как белок А из Staphylo o us aureus или антитела против иммуноглобулинов. Флуоресцентное окрашивание дает существенную информацию о распределении антигена в смешанных клеточных популяциях, однако наблюдения в микроскоп занимают много времени и их интерпретация не всегда объективна. К тому же флуоресцентный клеточный сортер не всегда доступен, и работа на нем обычно требует предварительных заявок и планирования. [c.218]

Используя те же клетки, можно начинать культивирование с клонирования одиночных клеток или проводить анализ методом лимитирующего разведения. В ряде случаев популяцию предшественников В-клеток обогащают или даже выделяют их в чистом виде с помощью положительной селекции, применяя моноклональные антитела к антигенам В-220, АА4.1 или GF1.2. При этом используют методики адсорбции на чашках (пен-нинг), образования розеток или применяют флуоресцентный клеточный сортер. Одиночные клетки можно поместить с помощью микроманипуляций в круглодонные лунки микропанелей и культивировать их в 200 мкл WEHI-K или в присутствии очищенного ИЛ-3. При этом среду меняют каждые 3 ср и положительные культуры размножают в лунках панелей Limbro и во флаконах для тканевых культур. [c.310]

На рис. 20-1 показана схема флуоресцентного клеточного сортера, который устроен примерно так же, как FA S II. В приборе можно выделить три основных блока 1) оптическую скамью, где производят измерения (и разделение) 2) блок обработки сигналов, где сигналы усиливаются и обрабатываются, принимаются решения об отнесении клетки к той или иной популяции при сортинге и сигналы переводятся в цифровую форму 3) блок сбора и обработки данных (например, компьютер). [c.327]

Рис. 20-1. Схема снабженного компьютером флуоресцентного клеточного сортера, аналогичного по конструкции прибору FA S II.

Одна из наиболее трудных проблем при цитометрии связана с неспецифическим окрашиванием. Клеточный сортер с чрезвычайно высокой чувствительностью детектирует флуоресцирующие молекулы — обычно с большей, чем глаз. Поэтому реагенты, используемые при работе с сортером, должны быть более высокой степени очистки, чем для других методов анализа. Как правило, гетерологичные сыворотки должны подвергаться очистке на аффинных сорбентах даже в тех случаях, когда они достаточно специфичны для непосредственного использования при флуоресцентной микроскопии. Моноклональные антитела не всегда требуют очистки. Мы с успехом использовали супернатанты многих продуцирующих моноклональные антитела гибридом, которые культивировали в средах с добавлением и без добавления сыворотки, а также асцитные жидкости (конечно, в соответствующем разведении). В случае непрямых методов флуоресцентного окрашивания влияние контаминирую-щих молекул в культуральных жидкостях сводится к минимуму. Если конъюгированные с флуорохромом антитела строго специфичны по отношению к иммуноглобулинам, то даже при связывании клетками молекул, не относящихся к иммуноглобулинам, эти молекулы не будут детектироваться (по флуоресценции). В случае применения асцитных жидкостей активность моноклональных антител обычно настолько высока, что эффекты контаминирующих иммуноглобулинов и других компонентов чаще всего не выявляются. Однако при прямом конъ-югировании препаратов антител с флуорохромом наличие в них белковых примесей неиммуноглобулиновой природы может стать причиной высокого уровня неспецифического окрашивания. Следовательно, любой конъюгат используемый при сортинге клеток, должен быть тщательно очищен. [c.332]

Тимоциты получали от трансгенных мышей, Т-клетки DS" которых несли ТкР, распознающий ВЛХМ в ассоциации с молекулой При помощи флуоресцентного клеточного сортера изучали экспрессию молекул D4 и D8 тимоцитами. При нормальном развитии клетки D4 D8 становились D4 D8 , а затем превращались в зрелые D4 D8 или D4 D8 либо погибали. В контроле (нетрансгенные мыши) основную популяцию тимоцитов составляли клетки D4 D8 и меньшие популяции - D4 D8 и D4 D8. У трансгенных мышей, экспрессирующих аллель происходила положительная селекция Т-клеток в тимусе, в результате чего формировалась гораздо более многочисленная популяция D4" D8. Такая селекция не происходила в отсутствие аллеля (Обозначения высокий , низкий , и относятся к уровню экспрессии маркеров D.) [c.250]

Рис. 4-38. Схема флуоресцентно-активируемого клеточного сортера. Лазерный щч анализирует флуоресценцию проходящих через него клеток. Капельки, содержащие отдельные клетки, в зависимости от наличия флуоресценции клеток заряжаются поло жительн о или отрицательно. Затем капельки направляют-ся в про бирки-накопители согласно з яду. Заметин что концентрация клеток должна бьпъ подобрана таким образов чтобы большая часть капель не с од ер жала клеток. Следовательно, большая часть капель наряду с любыми скоплениями клеток направляется в контейнер

Поглощение клеткой Fe -транс-ферринового комплекса опосредуется специфическим рецептором, представляющим собой гомодимер-ный гл и ко протеин клеточной мембраны. А. Для клонирования гена рецептора мышиные f/f-клетки котрансфицировали высокомолекулярными фрагментами суммарной ДНК человека и рекомбинантной плазмидой, содержащей ген тимидинкиназы tk) вируса герпеса. После отбора в среде HAT Г/С-клетки смешивали с антителами к рецептфу трансферрина человека. Клетки, связавшие антитела (и, следовательно, несущие рецептор), обрабатывали флуоресцентной меткой, отбирали с помощью сортера и клонировали. ДНК, выделенная из клонированных клеток, содержала значительно [c.314]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология