Количественные аспекты аффинной хроматографии

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ [c.197]

За последние 20 лет аффинная хроматография стала одним из наиболее эффективных методов выделения и очистки биополимеров. В настоящее время этот метод широко используется во многих лабораториях не только для рутинного выделения того или иного объекта, но и в качестве тонкого инструмента биохимического исследования, позволяющего изучать количественные параметры взаимодействия компонентов в биологических системах. В этой связи большое значение приобретает доступность практических руководств, посвященных химическим и методологическим аспектам аффинной хроматографии, В отечественной научной литературе остро ощущается отсутствие такого рода изданий. Вышедшая в 1980 г. в издательстве Мир монография Я. Турковой Аффинная хроматография в свое время несколько восполнила этот пробел, однако эта книга охватывает литературу только по 1976—1977 гг. [c.5]

Предлагаемое вниманию советского читателя руководство вышло в серии книг, посвященных актуальным методам современной биохимии и родственных областей естествознания. В нем собраны подробные экспериментальные методики, охватывающие практически все аспекты аффинной хроматографии получение, характеристика и применение твердых носителей, активация твердых носителей, иммобилизация на них лигандов различной природы, адсорбция и элюирование, анализ биоспе-цифических адсорбентов, использование аффинной хроматографии в препаративном масштабе и в условиях высокоэффективной хроматографии, количественная характеристика молекулярных взаимодействий, выделение клеток и другие. Хотя как практическое руководство данная книга призвана помочь исследователю прежде всего в экспериментальной работе, каждой главе предпослано небольшое теоретическое вступление. Особую ценность книге придает участие в ее написании ведущих специалистов по аффинной хроматографии из многих стран. [c.5]

Применение аффинной хроматографии в качестве метода изучения взаимодействий находится еще на ранней стадии развития, несмотря на то что количественная аффинная хроматография была введена уже десять лет назад [1—3]. Действительно, количество исследований, касающихся методологических аспектов аффинной хроматографии, примерно равно количеству сообщений по применению этого метода в конкретных экспериментальных системах. Большинство этих исследований способствовало применению аффинной хроматографии для оценки равновесия с участием ферментов и модификаторов, ингибиторов или субстратов [1—12], но метод был также использован и для характеристики взаимодействий белок — лекарственный препарат [13], система антиген — антитело [14] и, в меньшей степени, белок-белковых взаимодействий [15, 16]. По существу метод заключается в иммобилизации биоспецифической реагирующей группы X на инертной хроматографической матрице (например, часто на сефарозе) и определении средневзвешенных величин объема элюирования Уа распределяющегося растворенного вещества А в ряде хроматографических экспериментов, в которых растворенное вещество мигрирует в присутствии различных концентраций лиганда 5, также специфически взаимодействующего с А и/или X, В некоторых примерах различные изменения значения Уа отражали конкуренцию между растворенными и иммобилизованными реагентами за одно и то же положение в А [2—5, 7—14] в других изменения в величинахГд были обусловлены наличием взаимодействия иммобилизованного реагента X с бинарным А5-комплексом, образованным растворенным веществом и растворимым лигандом [1, 6]. Цель количественной аффинной хром ографии — объяснить возникновение изменений в величинах Га в предложении существования тех или иных равновесий. Поскольку положение равновесия зависит от концентрации (в соответствии с законом действия масс), точное определение состава смеси реагентов, к которой относится Га, обеспечивает применение фронтальной хроматографии [3, 4]. [c.192]

Хотя представления, положенные в основу этого обзора, несомненно, пригодны для изучения большого числа взаимодействий, их ни в коем случае нельзя считать подходящими абсолютно для всех систем. Например, ситуация, когда может происходить взаимодействие как А, так и его комплекса с лигандом и матрицей (/гдх и /гдзх — истинные константы), не рассматривалась в настоящем обзоре для этой ситуации предложена более сложная теория [19]. Однако, допуская, что единственная истинная константа ассоциации описывает все взаимодействия особого типа между растворенным веществом и матрицей, мы существенно ограничиваем область применения современных методик в количественной аффинной хроматографии с мультива-лентными растворенными веществами [18, 19]. Нетрудно представить себе, что последовательные взаимодействия растворенного вещества с матрицей могут характеризоваться увеличением или уменьшением констант связывания ввиду изменения стери-ческих факторов, связанных с расположением иммобилизованных групп X. Другой, уже обсуждавшийся аспект, ограничивающий применение настоящих методик, связан с допущением идентичности характеристик распределения в геле растворенного вещества и всех комплексов растворенное вещество — лиганд. Кроме того, совершенно не принимались во внимание кинетические соображения (химических процессов и массопередачи), касающиеся процесса распределения. В этом отношении более общая теория количественной аффинной хроматографии [34 показала, что ограничение значений констант скорости, вызванное предполагаемым достижением распределительного равновесия, вероятно, не имеет значения для исследований обычной колоночной хроматографии, но может сделать невозможным применение представленных выше выражений к результатам, полученным при высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием больших скоростей потока. Как отмечено в работе [35], возможное использование аффинной хроматографии для количественных исследований связывания лиганда, несом- [c.215]