Количественная аффинная хроматография

Разновидность количественной аффинной хроматографии — фронтальный анализ [10] он основан на понятии плотности о аффинного лиганда на единицу длины колонки с агарозой. Если / — общая длина колонки с агарозой, а Li — общее количество им мобилизованного лиганда в сорбенте, то о = - г/ - Если аффинный сорбент характеризуется слабым сродством, то раствор фермента в концентрации [ 0] наносится на колонку непрерывно, а для элюирования фермента с колонки необходим объем V. Можно написать следующее уравнение [c.51]

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ [c.197]

Принимая во внимание, что суммарная концентрация доступных положений матрицы /пх должна быть рассчитана по экспериментальным данным, колоночная хроматография представляет собой простейший метод количественной аффинной хроматографии, поскольку найденное из эксперимента значение гпх затем будет использоваться в расчетах других экспериментов, выполненных на той же колонке с тем же растворенным веществом. Однако в некоторых примерах, особенно в случае биологических аффинных матриц, таких, как миофибриллы мышц [28], колоночный метод нельзя использовать из-за проблем, связанных со скоростью потока, поэтому в количественной аффинной хроматографии находят применение также эксперименты распределительного равновесия. [c.197]

Методика проведения количественной аффинной хроматографии не отличается существенно от обычного колоночного эксперимента, за исключением необходимости проведения экспериментов в сравнительно небольшом масштабе. Тем не менее следует принять во внимание следующие соображения. [c.197]

КОЛИЧЕСТВЕННАЯ АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ С ЗОНАЛЬНЫМ ЭЛЮИРОВАНИЕМ И АНАЛИЗ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ [c.217]

Фронтальная хроматография отличается от зонального варианта лишь объемом раствора, вводимого на колонку. На колонку вводится объем раствора, достаточный для того, чтобы профиль элюирования содержал участок плато, в котором концентрации всех растворенных реагентов равны их концентрациям во вводимом растворе. Как и в зональном методе, рекомендуется элюирование буфером. Полученные таким образом кривые элюирования представляют собой комбинацию двух участков начального участка (восходящий профиль), отражающего увеличение концентраций всех растворенных компонентов от нуля до концентраций наносимой на колонку смеси, и конечного участка (нисходящий профиль), соответствующего уменьшению концентраций всех компонентов от значения плато до нуля. В количественной аффинной хроматографии, где обычно используются процессы связывания, происходящие количественно, т. е. специфично для суммарной концентрации растворенного вещества, объем элюирования Уа может быть получен как среднее значение сечения (центроида) [29] начального или конечного участка кривой элюирования. Положение этого сечения определяется математическим выражением [c.198]

Рис. 3. графическое определение констант равновесия для взаимодействия лизоцима с сефадексом 0-100 (Ках) и глюкозой (/Саз) с помощью количественной аффинной хроматографии, а — влияние концентрации глюкозы на объем элюирования Уа лизоцима в экспериментах с 8,3 мкМ фермента б — концентрационная зависимость объема элюирования Уа для лизоцима в отсутствие глюкозы [3]. (Воспроизведено с разрешения.) [c.204]

Множественные взаимодействия растворенных веществ с участками связывания матрицы рассматривались лишь в четырех исследованиях по количественной аффинной хроматографии. [c.206]

Из четырех параметров, значения котор 1х выводятся в количественной аффинной хроматографии (/, тх и две константы равновесия), валентность растворенного вещества и одна константа равновесия устанавливаются в ходе определения тх. Следовательно, остается единственная проблема определения значения другой истинной константы ассоциации, что представляет собой относительно простую задачу. Независимо от рассматриваемого конкретного случая (примеры 1—4) необходимые экспериментальные данные должны включать (Уа /Га) или [c.213]

Количественная аффинная хроматография [c.219]

Количественная аффинная хроматография 221 [c.221]

Таблица 1, Характеристика аффинных матриц, анализ кривых при количественной аффинной хроматографии

Наиболее часто используемый метод количественной аффинной хроматографии основан на элюировании биологических макромолекул с аффинной матрицы растворами аффинантов в различных концентрациях [7]. [c.45]

Применение аффинной хроматографии в качестве метода изучения взаимодействий находится еще на ранней стадии развития, несмотря на то что количественная аффинная хроматография была введена уже десять лет назад [1—3]. Действительно, количество исследований, касающихся методологических аспектов аффинной хроматографии, примерно равно количеству сообщений по применению этого метода в конкретных экспериментальных системах. Большинство этих исследований способствовало применению аффинной хроматографии для оценки равновесия с участием ферментов и модификаторов, ингибиторов или субстратов [1—12], но метод был также использован и для характеристики взаимодействий белок — лекарственный препарат [13], система антиген — антитело [14] и, в меньшей степени, белок-белковых взаимодействий [15, 16]. По существу метод заключается в иммобилизации биоспецифической реагирующей группы X на инертной хроматографической матрице (например, часто на сефарозе) и определении средневзвешенных величин объема элюирования Уа распределяющегося растворенного вещества А в ряде хроматографических экспериментов, в которых растворенное вещество мигрирует в присутствии различных концентраций лиганда 5, также специфически взаимодействующего с А и/или X, В некоторых примерах различные изменения значения Уа отражали конкуренцию между растворенными и иммобилизованными реагентами за одно и то же положение в А [2—5, 7—14] в других изменения в величинахГд были обусловлены наличием взаимодействия иммобилизованного реагента X с бинарным А5-комплексом, образованным растворенным веществом и растворимым лигандом [1, 6]. Цель количественной аффинной хром ографии — объяснить возникновение изменений в величинах Га в предложении существования тех или иных равновесий. Поскольку положение равновесия зависит от концентрации (в соответствии с законом действия масс), точное определение состава смеси реагентов, к которой относится Га, обеспечивает применение фронтальной хроматографии [3, 4]. [c.192]

Первоначально количественная аффинная хроматография ограничивалась определением констант ассоциации для систем, в которых распределяющееся вещество А, находящееся в растворе, имело только одно положение для взаимодействия с X и/или S, но последующее развитие метода [17—19] дало возможность учитывать и мультивалентность растворенного вещества. Существующая теория, однако, ограничена или системами, в которых не происходит распределения растворенного вещества по гелю, или системами с достаточно небольшим лигандом, что позволяет считать хроматографические распределительные характеристики для А и всех АЗгКОмплексов очень близкими. Первый отмеченный случай, вероятно, наблюдается, когда и растворенное вещество и лиганд — макромолекулярные соединения при этом можно выбрать подходящий аффинный адсорбент, исключающий реагент большей молекулярной массы. Хотя теория мультивалентных растворенных веществ должна, разумеется, включать также и специальный случай одновалентного вещества, концепции количественной аффинной хроматографии легче понять при первоначальном рассмотрении простейших ситуаций. [c.193]

Зональный метод количественной аффинной хроматографии [1, 2, 5] в настоящее время пользуется большей популярностью, чем фронтальный, главным образом из-за применения в последнем методе слишком большого количества растворенного вещества. Однако различия в требуемом количестве растворенного вещества не так велики, как может показаться на первый взгляд. Хотя в случае фронтального эксперимента объем вводимого раствора гораздо больше, концентрация может быть значительно ниже ввиду отсутствия далее в работе какого бы то ни было разбавления. Это положение становится совершенно очевидным из рис. 1, на котором представлены восходящие профили элюирования при различных концентрациях NADH при фронтальной аффинной хроматографии лактатдегидрогеназы печени крысы на колонке объемом 0,1 мл (0,08x5,0 см) с 10-карбокси-дециламино-сефарозой в сравнении с соответствующими профилями, полученными при зональной хроматографии на колонке с тем же аффинным адсорбентом, объем которой в 10 раз больше (0,50X1,28 см) [20]. [c.199]

Существенным этапом исследований по количественной аффинной хроматографии, включая как моновалентные, так и мультнвалентные растворенные вещества, является определение суммарной концентрации доступных положений связывания матрицы. На этой стадии были разработаны методики для количественного определения тх, испытанные на системах, в которых А взаимодействует непосредственно с X (пример 3, но приемлемо также для примера 4). Однако ввиду отсутствия сообщений об исследованиях лигандзадерживаемого элюирования в системах с мультивалентным растворенным веществом, для этих систем не имеется экспериментально проверенных методик. Поэтому основное внимание уделяется главным образом методам [c.207]

На протяжении последнего десятилетия мы стали свидетелями появления количественной аффинной хроматографии как метода изучения взаимодействий между различными реагирующими веществами. Этот еще относительно молодой метод вызывает несомненный интерес, поскольку в некоторых случаях дает возможность на основе специфического взаимодействия с иммобилизованным реагентом количественно оценивать обратимую реакцию, протекающую в биологических условиях, что продемонстрировано на примере использования оксамат-сефарозы для изучения взаимодействия NADH с различными изоферментными формами лактатдегидрогеназы в неочищенном тканевом экстракте [6]. Другим преимуществом аффинной хроматографии, вероятно, является отсутствие каких-либо ограничений для значений констант равновесия, которые могут быть измерены этим методом. Из двух рассмотренных здесь подробно примеров очевидно, что количественная аффинная хроматография весьма удобна для характеристики относительно слабых взаимодействий ( As<1000 М ), оценка которых вызывает затруднения при использовании других методов, таких, как равновесный диализ , из-за сложности измерения различий между полной и свободной [c.214]

Хотя представления, положенные в основу этого обзора, несомненно, пригодны для изучения большого числа взаимодействий, их ни в коем случае нельзя считать подходящими абсолютно для всех систем. Например, ситуация, когда может происходить взаимодействие как А, так и его комплекса с лигандом и матрицей (/гдх и /гдзх — истинные константы), не рассматривалась в настоящем обзоре для этой ситуации предложена более сложная теория [19]. Однако, допуская, что единственная истинная константа ассоциации описывает все взаимодействия особого типа между растворенным веществом и матрицей, мы существенно ограничиваем область применения современных методик в количественной аффинной хроматографии с мультива-лентными растворенными веществами [18, 19]. Нетрудно представить себе, что последовательные взаимодействия растворенного вещества с матрицей могут характеризоваться увеличением или уменьшением констант связывания ввиду изменения стери-ческих факторов, связанных с расположением иммобилизованных групп X. Другой, уже обсуждавшийся аспект, ограничивающий применение настоящих методик, связан с допущением идентичности характеристик распределения в геле растворенного вещества и всех комплексов растворенное вещество — лиганд. Кроме того, совершенно не принимались во внимание кинетические соображения (химических процессов и массопередачи), касающиеся процесса распределения. В этом отношении более общая теория количественной аффинной хроматографии [34 показала, что ограничение значений констант скорости, вызванное предполагаемым достижением распределительного равновесия, вероятно, не имеет значения для исследований обычной колоночной хроматографии, но может сделать невозможным применение представленных выше выражений к результатам, полученным при высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием больших скоростей потока. Как отмечено в работе [35], возможное использование аффинной хроматографии для количественных исследований связывания лиганда, несом- [c.215]

Показано, что конденсация трипептида (свободная кислота) с агарозным твердым носителем через аминоалкильную вставку приводит к эффективному и удобному аффинному адсорбенту, который можно использовать и в препаративной, и в количественной аффинной хроматографии нейрофизи-нов (4, 20]. [c.229]

С использованием количественной аффинной хроматографии с зональным элюированием был изучен ряд взаимодействующих систем белок — лиганд и белок — белок. Ниже приведены несколько типичных примеров, показывающих обычные хроматографические результаты, получаемые при изучении моновалентных (например, нуклеаза стафилококков — нуклеотид), бивалентных (например, ТЕРС 15 IgA бивалентный мономер — фосфорилхолин) и кооперативных (например, БФН-П — пептидный гормон) взаимодействующих систем. [c.233]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология