Протеиназа использование для выделения ДНК

Альтернативные методы скрининга космидных библиотек, описанные в гл. 3, предполагают селекцию космидных клонов с использованием феномена гомологичной рекомбинации in vivo. Остальные главы книги посвящены вопросам, связанным с экспрессией клонированных генов. Для многих белков млекопитающих удалось осуществить высокопродуктивную внутриклеточную экспрессию в Е. oli. Однако гетерологические белки, локализующиеся в цитоплазме, часто образуют трудно растворимые агрегаты, что значительно осложняет получение нативного продукта. В гл. 4 описаны эффективные способы выделения активных растворимых продуктов из нерастворимых белков цитоплазмы Е. соИ. Вероятность деградации специфическими бактериальными протеиназами многих эукариотических белков, синтезируемых в Е. oli, может быть существенно снижена, если их экспрессировать в виде гибридных белков. Такие составные белки, в которых бактериальный компонент обычно представлен -галактозидазой, можно использовать в качестве иммуногенов для получения антисыворотки и моноклональных антител к клонированному эукариотическому белковому домену. Эти вопросы >ассматриваются в двух главах — одна посвящена получению поликлональной антисыворотки, а другая — методам гибридной технологии. В последующих главах книги описаны современные эукариотические экспрессирующие системы в гл. 7 — дрожжевая, далее в трех главах — системы на основе культивируемых клеток млекопитающих и трансгенные животные. В частности, описана система экспрессии с использованием векторов, которые несут гены, обеспечивающие возможность их индуцибельной амплификации это позволяет снимать токсическое действие антибиотиков, введенных в культуральную среду. Клонированные в таком векторе гены также [c.8]

Процедура включает в себя этапы выделения ДНК из волоса с использованием органических растворителей. Основной этап состоит из лизиса клеток и деградации белковых молекул экстракционным (лизирующим) буфером, содержащим дитиотрейтол и протеиназу К. После лизиса следует депротеинизация образца смесью фенол/хлороформ/изоамиловый спирт. Очистку от ингибиторов и корщентрирование раствора ДНК с использованием устройства — концентратора entri on 100. [c.149]

Клетки растений обычно разрушают в водных растворах в присутствии хелатирующих агентов, подавляющих нуклеазную активность, и детергентов, которые растворяют мембраны. После разрушения клеток белки денатурируют н осаждают из экстракта, для чего часто используют фенол либо смесь хлороформа с октанолом. Некоторые методики для освобождения ДНК от белков хроматина предусматривают использование протеиназы (разд. 4.2.3.2). После депротеинизации раствор ДНК все еще сильно загрязнен РНК и углеводами и, следовательно, обычно подлежит дальнейшей очистке, техника которой в определенной степени зависит как от количества использованной для выделения ткани, так и от целей эксперимента. [c.237]

Если требуются более чистые препараты ДНК, то раствор-нуклеиновой кислоты после повторного растворения можно очистить в градиенте плотности s l/БЭ (приложение 4[И]). В разд. 4.2.3.1 приведен метод выделения небольших количеств ДНК из лиофилизированных тканей, а процедура крупномасштабного выделения описана в приложении 4[1]. Лишь при выделении ДНК из некоторых лиофилизированных тканей (например, листьев злаков) метод, основанный на использовании СТАВ, оказался не совсем удачным. В разд. 4,2.3.2 приведен другой метод, основанный на обработке содержимого клеток, разрушенных протеиназой в присутствии детергента (доде-цилсульфата натрия, ДСН), и последующем концентрировании ДНК путем осаждения спиртом. При этом обработка нуклеиновых кислот более мягкая, на всех стадиях удается избежать их чрезмерной деградации, и, таким образом, полученные препараты ДНК обладают довольно большой мол. массой (>100 т.п.н.), что вполне подходит для клонирования генома.. [c.240]

Выделение ДНК из некоторых лиофилизированных тканей например содержащих многочисленные вторично утолщенные-клетки и сосуды, может быть затруднено. В отдельных случаях для выделения нуклеиновых кислот из свежего материала мож-но использовать СТАВ-метод (разд. 4.3.2), однако для других тканей могут потребоваться иные методики. Большинство из них тоже основано на использовании детергента, вызывающего быструю денатурацию белков (при этом инактивируются и нуклеазы) и растворение мембран. Один из таких методов, впервые разработанный Деллапорта с сотрудниками [4], изложен в разд. 4.3.3. При 0°С примеси белка и полисахаридов в экстрактах образуют комплексы с додецилацетатом калия и выпадают в осадок, а нуклеиновые кислоты остаются в растворе. Препараты. ДНК, полученные с помощью данного метода, могут использоваться для лигирования. Микрометод, основанный на применении ДНС и протеиназы К, представлен в разд. 4.3.4. [c.248]

В целом, введение аффинных меток в виде обсуждавшихся выше пептидных и полипептидных последовательностей существенно облегчает очистку меченых таким образом рекомбинантных белков, а также предоставляет дополнительные возможности наблюдать за эффективностью экспрессии рекомбинантных генов. Выбор для этих целей системы очистки зависит от конкретного белка, который предстоит получать в очищенном состоянии, а также от целей его дальнейшего использования. В ряде современных систем в рекомбинантные белки вводится двойная аффинная метка, одна из которых служит для очистки белка, а другая - для мониторинга за его биосинтезом. Также с помощью двойной метки может быть достигнута большая степень очистки рекомбинантных белков. Разработаны множественные аффинные аминокислотные последовательности, которые включают в себя кальмодулин-связывающий пептид, специфический сайт расщепления протеиназой и белок А для иммобилизации всей рекомбинантной конструкции. С помощью этих систем удается изучать белок-белковые взаимодействия путем выделения соответствующих белковых комплексов при исследованиях протеома [183, 184]. Методы иммобилизации белков с помощью аффинных последовательностей используются при создании пептидных и белковых микрочипов, клонотек на их основе, для адресной доставки белков и во многих других приложениях. О некоторых из них будет дополнительно рассказано в разделе П.3.2. [c.132]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология