Детергенты, выделение нуклеиновых кислот

Для выделения нуклеиновых кислот из клеток обычно применяют мягкие методы их разрушения, включающие использование детергентов и лизоцима, хотя для разрушения некоторых микроорганизмов с прочными клеточными стенками может понадобиться пресс, стеклянные бусы или растирание клеток с абразивами (см. раздел 8.1.2). В некоторых случаях для ослабления клеточных стенок в растущие культуры (например, грамположительных бактерий) добавляют глицин, лизин или треонин. Иногда для тех же целей клетки грамположительных бактерий в растущих культурах обрабатывают антибиотиками, такими как пенициллин С или ме-тициллин, которые подавляют биосинтез пептидогликана клеточной стенки. Чувствительность к лизоциму микобактерий, содержащих высокий процент липидов и полисахаридов в клеточной стенке, может быть усилена их обработкой изопропанолом. При лизисе микроорганизмов, имеющих особенно прочные клеточные стенки, применяют поли(этиленгликоль) с последующим удалением из лизата, так как его присутствие мешает проведению дальнейшей очистки ДНК- [c.143]

Первый этап при выделении нуклеиновых кислот — это разрушение бактериальных клеток. В зависимости от природы клеточной стенки бактерии могут быть разрушены 1) с помощью одного лишь детергента, 2) с использованием сочетания действия детергентов и гидролитических ферментов или 3) с помощью физических методов, таких, как разрушение под действием ультразвука, в результате резкого изменения давления или при встряхивании со стеклянными шариками. [c.112]

Сочетание детергента с фенолом для выделения нуклеиновых кислот особенно широкое распространение получило в последнее время. Выделяемые этим методом препараты нуклеиновых кислот отличаются высокой степенью чистоты По всем известным критериям они вполне нативны, хотя и не всегда инфекционны. [c.163]

Одни методы разрушения вирусов особенно хорошо приспособлены для получения нативных белков, а другие — для получения интактных нуклеиновых кислот. Во всех наиболее удачных методах выделения белков весь процесс проводят на холоду, но при этом используют растворы с низкими или высокими значениями pH, а при таких значениях pH возникает опасность разрушения нуклеиновых кислот. В отличие от этого при использовании двух наиболее широко распространенных методов выделения инфекционных нуклеиновых кислот, а именно методов с применением детергентов и фенола, которые иногда используют в сочетании друг с другом, разрушение вирусов проводят при нейтральном значении pH, хотя в некоторых случаях при этом необходимо применять повышенные температуры. Инфекционную РНК можно выделить также путем нагревания вируса в солевых растворах. [c.56]

Для выделения суммарной фракции ДНК разрушают плазматическую, ядерную и митохондриальные мембраны и освобождаются от белков. Один из широко используемых методов получения чистых препаратов нативной ДНК, не содержащих белков, заключается в деструкции тканей и клеток анионными детергентами типа додецилсульфата натрия с последующим отделением белков в виде осадка, при сохранении нуклеиновой кислоты в растворе. Далее ДНК выделяют осаждением в этаноле солевого раствора нуклеиновой кислоты, или концентрированием исходного раствора, пропуская его через [c.71]

При очистке больших количеств макромолекул, где требуются различные виды фракционирования, часто бывает необходимо удалить соли, сменить буфер, сконцентрировать вещество, удалить вещества типа фенола и детергенты, используемые при выделении и очистке нуклеиновых кислот. Эти процедуры часто занимают много времени (например, осаждение или диализ) и поэтому могут приводить к потерям нестабильных веществ. Гель-проникающая хроматография позволяет быстро решить эти задачи. Например, соли и небольшие молекулы легко могут быть удалены, поскольку они задерживаются всеми гелями. [c.202]

Всякому структурному исследованию ДНК или РНК предшествуют выделение их из клеток, очистка и фракционирование. Поскольку в клетке нуклеиновые кислоты практически всегда находятся в комплексес белками (т. е. в вил, нуклеопротеидов), их выделение сводится в основном к очистке от белков (депротеинизации). Чаще всего нуклеиновые кислоты экстрагируют из гомогенатов клеток или очищенных клеточных органелл смесью фенол — вода В присутствии ионных детергентов (например, додецилсульфата натрия). При этом белки (и ряд других клеточных компонентов) переходят в органическую фазу, а нуклеиновая кислота остается в водной фазе. Из водного раствора ДНК или РНК осаждают спиртом. [c.10]

Из рис. 3 видно, что раннее действие рентгеновского облучения in vivo и действие детергента (додецилсульфата) сходны. Детергенты, как известно, применяют при выделении нуклеиновых кислот для их депротеи низации. [c.49]

Лиофилизацня весьма удобна для хранения растительного материала перед выделением ДНК. В течение некоторого промежутка времени можно высушивать и накапливать образцы растительного материала для последующего одновременного выделения нуклеиновых кислот. Лиофилизированный растительный материал можно хранить в течение нескольких лет, причем качество получаемых из него препаратов ДНК со временем -снижается незначительно. Высушенную ткань легко разрушить размалыванием или растиранием. Лиофилизация позволяет сохранить целостность ДНК, поскольку обезвоженная нуклеиновая кислота в меньшей степени подвержена распаду, а нукле-азная деградация сведена к минимуму, так как гидратация происходит в присутствии хелатирующих веществ и детергентов, подавляющих нуклеазную активность. [c.239]

Выделение ДНК из некоторых лиофилизированных тканей например содержащих многочисленные вторично утолщенные-клетки и сосуды, может быть затруднено. В отдельных случаях для выделения нуклеиновых кислот из свежего материала мож-но использовать СТАВ-метод (разд. 4.3.2), однако для других тканей могут потребоваться иные методики. Большинство из них тоже основано на использовании детергента, вызывающего быструю денатурацию белков (при этом инактивируются и нуклеазы) и растворение мембран. Один из таких методов, впервые разработанный Деллапорта с сотрудниками [4], изложен в разд. 4.3.3. При 0°С примеси белка и полисахаридов в экстрактах образуют комплексы с додецилацетатом калия и выпадают в осадок, а нуклеиновые кислоты остаются в растворе. Препараты. ДНК, полученные с помощью данного метода, могут использоваться для лигирования. Микрометод, основанный на применении ДНС и протеиназы К, представлен в разд. 4.3.4. [c.248]

Несколько лет назад я отмечал, что выделение ДНК из спермы рыб резко падает после облучения электронами, если для очистки использовать метод с детергентом (додецилсульфат натрия) [20]. Со временем мы склонились к мнению, что эти потери связаны с образованием сшивок между молекулами ДНК- Однако последующие наблюдения показали, что обработка спермы облученной рыбы трипсином уничтожила разницу в количестве выделенной ДНК, хотя количество белка должно быть очень малым [21]. Было высказано предположение, что аналогичные потери нуклеиновой кислоты в результате сшивок с белком можно вызвать ультрафиолетовым излучением. О таком эффекте сообщается в двух работах. Smith [и] нашел, что если облучать культуры Е. соИ и клетки экстрагировать с детергентом (додецилсульфат-натрия), то количество выделенной ДНК заметно уменьшается с увеличением дозы ультрафиолетового излучения (рис. 3) [22]. Автор проверил, что это не было связано с нарушением лизиса клеток. Можно видеть, что такой эффект выражен значительно сильнее, чем образование димеров тимина. Smith указывает, что этот эф- [c.122]

Если требуются более чистые препараты ДНК, то раствор-нуклеиновой кислоты после повторного растворения можно очистить в градиенте плотности s l/БЭ (приложение 4[И]). В разд. 4.2.3.1 приведен метод выделения небольших количеств ДНК из лиофилизированных тканей, а процедура крупномасштабного выделения описана в приложении 4[1]. Лишь при выделении ДНК из некоторых лиофилизированных тканей (например, листьев злаков) метод, основанный на использовании СТАВ, оказался не совсем удачным. В разд. 4,2.3.2 приведен другой метод, основанный на обработке содержимого клеток, разрушенных протеиназой в присутствии детергента (доде-цилсульфата натрия, ДСН), и последующем концентрировании ДНК путем осаждения спиртом. При этом обработка нуклеиновых кислот более мягкая, на всех стадиях удается избежать их чрезмерной деградации, и, таким образом, полученные препараты ДНК обладают довольно большой мол. массой (>100 т.п.н.), что вполне подходит для клонирования генома.. [c.240]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология