Нуклеиновые кислоты удаление из белковых растворов

С печенью, в ряде случаев удоОно предварительно отделить цитоплазму от ядер и использовать только цитоплазму. Это можно осуществить путем экстрагирования гомогенизированной ткани 0,14 М раствором Na l, приводящего к отделению цитоплазматических рибонуклеопротендов от содержащего ДНК ядерного материала. Рибонуклеонротеид осаждают затем из экстракта при pH 4,5 и вновь растворяют его в растворе бикарбоната натрия. Продолжительное встряхивание с несколькими последовательно сменяемыми порциями хлороформа, содержащего небольшое количество октилового спирта, приводит к удалению белка нуклеиновую кислоту, остающуюся в водном растворе, осаждают в виде натриевой соли при добавлении спирта. Можно поступить и иначе вызвать спиртом денатурацию рибонуклеопротеида и экстрагировать нуклеиновую кислоту 10%-ным раствором хлористого натрия, из которого затем осадить ее добавлением двух объемов спирта [1—4]. Примерно аналогичный метод существует и для выделения РНК из животных тканей [5]. В этом случае нуклеиновую кислоту осаждают из раствора солянокислого гуанидина, в котором белок нерастворим для удаления белка можно использовать также додецилсульфат натрия [6, 7]. [c.40]

При выделении высокомолекулярных соединений из смесей природного происхождения помимо солей иногда применяют в достаточно высоких концентрациях и иные реактивы. На последующих стадиях выделения бывает весьма желательно вновь удалить их из смеси. В качестве наиболее убедительного примера на фиг. 23 показано удаление фенола из раствора ДНК [10]. Фенол применяют обычно для отделения нуклеиновых кислот от белков. Раньше от фенола [c.140]

Линейное расположение наследственных факторов в хромосоме позволяет предположить, что ДНК, составляющая основную часть этих факторов, располагается в хромосоме Б строго определенном порядке. Мы установили, что она связана с белком, который образует каркас , или скелет , хромосомы. В пробирке из массы изолированных хромосом можно выделить все сильно щелочные белки. Это делается с помощью концентрированного, слегка подкисленного солевого раствора. Даже после удаления щелочных белков вид хромосом под микроскопом не изменяется, а при помещении их в нейтральную среду они сохраняют свою ДНК. Последнее свидетельствует о том, что ДНК в хромосомах с чем-то связана, так как в этой среде она обычно растворима если бы ДНК не была связана, то она бы просто растворилась и вышла из хромосом. Вещество, с которым связана ДНК, представляет собой белок. Это доказывается действием на хромосомы чистого кристаллического трипсина, который переваривает белки. Полимеризованная ДНК при этом освобождается и образует плотный студень. Если же расщепить ДНК хромосом ферментом, который разрушает нуклеиновые кислоты, то остается белок в виде массы тонких извитых нитей, совершенно непохожих на хромосомы. При отделении его от ДНК он уплотнился и изменил свою форму. Видимые в микроскоп хромосомы представляют собой результат соединения этого белка с ДНК (к которой присоединен также [c.118]

Пожалуй, наиболее полной экстракции рибосомных белков можно добиться путем разрушения структуры рибосом под действием ДСН [1375]. В этом случае рибосомные белки образуют комплексы с ДСН, которые можно подвергать электрофорезу в ДСН-содержащих гелях без предварительного удаления нуклеиновых кислот. В практическом отношении применение ДСН очень удобно, поскольку это позволяет анализировать небольшие количества рибосом или рибосомных субчастиц. Так, например, из фракций, полученных при центрифугировании в градиенте плотности, можно выделить рибосомные субчастицы путем осаждения ТХУ. Осадки после нейтрализации растворяют в буфере, содержащем ДСН [599], и белки разделяют электрофорезом в соответствии с их молекулярными массами. [c.310]

Обессоливание растворов. С помощью колонки, заполненной сефадексом G-25, можно проводить обессоливание растворов высокомолекулярных соединений. Фракции высокомолекулярных соединений элюируются с внешним объемом колонки, в то время как фракции, содержащие низкомолекулярные соединения, распределяются между подвижной и неподвижной фазами и поэтому движутся с меньшей скоростью. Обессоливание — более быстрый и эффективный метод, чем диализ, и используется, в частности, для удаления фенола из растворов нуклеиновых кислот, сульфата аммония из растворов белков, а также для отделения моносахаридов от полисахаридов и аминокислот от белков. [c.100]

Стадия 3. Окончательное удаление нуклеиновых кислот и предварительное удаление некоторых белков автолизом. Для активации нуклеаз к смеси добавляют хлористый магний. После продолжительной инкубации почти все нуклеиновые кислоты распадаются до нуклеотидов и небольших олигонуклеотидов, которые остаются в растворе при осаждении белков на стадии 4. [c.219]

Выделение нуклеиновых кислот. Большая часть нуклеиновых кислот в растительных, животных и бактериальных клетках находится в соединении с белками. Поэтому, кроме разрушения клеточньк оболочек путем гомогенизации биологического материала, для выделения нуклеиновьа кислот необходимо разорвать связь между нуклеиновой кислотой и белком. Это достигается обработкой материала крепким раствором соли, например 10%-ным раствором Na l. Одновременно осуществляется извлечение нуклеиновых кислот. После удаления твердого остатка нуклеиновые кислоты осаждают из охлажденного до 0° С раствора этанолом или раствором трихлоруксусной кислоты. Осадок нуклеиновых кислот отделяют центрифугированием, тщательно промывают и высушивают. [c.189]

К недостаткам стрептомицинсульфатного метода следует отнести возможную потерю целевых ферментов. Следует предположить, что в каждом конкретном случае распределение нуклеиновых кислот и белков (в том числе нуклеаз, фосфатаз и рестриктаз) между осадком и раствором зависит от индивидуальных свойств этих компонентов и их проявления в условиях конкретного эксперимента. Предположительно соосаждение с нуклеиновыми кислотами может привести как к ощутимым потерям целевых ферментов, так и к их определенной функциональной очистке (в случае избирательного перехода в осадок нежелательных примесей). К сожалению, в литературе, описывающей применение СС для удаления нуклеиновых кислот в опытах по выделению рестриктаз, отсутствуют конкретные данные, отражающие характер распределения компонентов бес-клеточного экстракта между осадком и супернатантом. Поэтому приходится лишь ограничиться замечанием, что наличие сведений об использовании в обсуждаемых экспериментах различных концентраций СС (0,5—4%) [115, 184, 186, 273] может быть принято как указание на возможность при ее помощи влиять на судьбу целевых ферментов и нежелательных примесей. В этом плане представляют интерес данные об ощутимых различиях в выходе рестриктазы E oR I, выделенной по двум схемам [184, 273], что во многом может быть объяснено неодинаковыми потерями целевого фермента на стадии удаления нуклеиновых кислот, проведенной с использованием различных концентраций СС. [c.145]

Для хроматографии белков применяют преимущественно ДЭАЭ-целлюлозу, значительно реже КМ-целлюлозу. ТЭЛЭ-целлюлоза применяется редко, и остается неясным, имеет ли она преимуще- тва по сравнению с ДЭАЭ-целлюлозой. ЭКТЭОЛА-целлюлоза служит преимущественно для разделения нуклеиновых кислот и эффективна при удалении последних, а также пигментов из белковых растворов [45]. При тонкослойной хроматографии на ДЭАЭ- и ЭКТЭОЛА-целлюлозах достигается наиболее быстрое разделение нуклеотидов по сравнению со всеми известными в настоящее время методами [46]. [c.220]

Исследовали действие НММ на ДНП в составе интактных спермиев быков и ядер, выделенных из отмытых от семенной плазмы клеток. Для выделения ядер суспензию сперматозоидов в 0,05 М трис-]ЯС1 буфере (pH 8,2), содержащем 0,01% трипсина, инкубировали 1 час на магнитной мешалке нри 20°. Действие трипсина останавливали понижением температуры. Ядра осаждали центрифугированием при 8—10 тыс. д и промывали дважды стандартным раствором Na l с ЭДТА. Для удаления хвостов осадок ядер растирали в стеклянном гомогенизаторе Поттера и многократно промывали трис-ЯС1 буфером, постепенно понижая концептрации с 0,05 до 0,001 М. Сунернатанты анализировали на содержание белка и нуклеиновых кислот по интенсивности поглощения в ультрафиолетовой части спектра на СФ=16. [c.324]

Однако реакция альдегида с амином имеет тот недостаток, что она обратима. А это значит, что при удалении избытка альдегида или разбавлении раствора инфекционность может быть восстановлена. Кроме того, амино-оксиметильные группы весьма реакциопноспособпы как в белках, так и в нуклеиновых кислотах и имеют тенденцию к медленному образованию более или менее стабильных метиленовых поперечных сшивок в результате вторичных реакций конденсации с разнообразными группами [121, 131] (табл. 10). Таким образом, постепенно [c.194]

Феномен молекулярного импринтинга был впервые обнаружен в 1972 г. Для его реализации в водном растворе получают ма-кромолекулярные комплексы низкомолекулярных лигандов с полимерами, которые далее высушивают и промывают растворителем, избирательно освобождающим комплексы от лиганда, но не растворяющим макромолекулы [163]. Поскольку подвижность макромолекул в твердой фазе ограничена, они сохраняют конформацию, которая была индуцирована в них соответствующим лигандом, даже после его удаления из комплекса. В итоге образуется новый класс искусственных материалов, обладающих свойствами специфических рецепторов, поскольку заключают в себе отпечаток пространственной структуры лиганда-матрицы. Такие материалы обладают высоким сродством и избирательностью по отношению к лигандам, уникальной стабильностью, значительно превышающей таковую природных биоматериалов, и их довольно просто получать в большом количестве. Они активно внедряются в практику для синтеза, разделения, идентификации и связывания матричных лигандов и их производных, а также создания биосенсоров. Лигандами же могут служить микроорганизмы, белки, нуклеиновые кислоты, аминокислоты, сахара, алкалоиды, стероидные соединения, токсины, гербициды, ароматические и гетероциклические химические соединения, ионы металлов и вещества в газообразной фазе. [c.374]

Объекты после фиксации в 10%-м растворе формалина в течение 3—6 ч промывают в проточной воде 10—12 ч, обезвоживают и по обычной методике парафинируют. Краситель готовят, растворяя 100 мг прочного зеленого в 10 мл воды, и доводят pH до 8. Перед окрашиванием срезы помещают в 5%)-й раствор трихлоруксусной кислоты на 15 мин при 100для удаления нуклеиновых кислот, которые могут маскировать окраску иа белки. Последовательность работы следующая. [c.94]

После удаления нуклеиновых кислот в растворе могут остаться капсульные камедеподобные углеводы. Это создает трудности при использовании обычных методов осаждения белков. В присутствии этих веществ невозможно применение сульфата аммония и других методов фракционного осаждения. Лучше полностью осадить белок в надежде, что камедеподобные вещества останутся в растворе. Практически весь белок можно осадить при 80%-ном насыщении сульфатом аммония (разд. 3.3) или 55%-ной концентрации ацетона (разд. 3.4). В случае использования сульфата аммония для осаждения белка может понадобиться скоростное центрифугирование. Но даже после этого растворенный белковый осадок содержит вещества, снижающие воспроизводимость результатов при работе на колонке или при использовании других методов фракционирования. [c.50]

Метод состоит в следующем. Питательную среду сливают, а клеточный монослой заливают 10%-ным раствором дезоксихолата натрия в насыщенном растворе мочевины в воде (1 г мочевины на 1 мл бидистиллированной воды при 22 ) примерно 1—2 мл на 3X10 клеток. Клетки обрабатывают 30—60 минут при комнатной температуре. Лизис контролируют под микроскопом. Клетки разрушаются в течение нескольких минут, а лизис наступает после разбавления смеси до 5—10% конечной концентрации лизата, Разведение можно производить исходной культуральной жидкостью, стерильной водой или физиологическим раствором, охлажденными до 4 В этих условиях происходит полный цитолизис Центрифугирование лизата при 10 ООО об/мин не ведет к образованию осадка, характерного для обломков клеток. Наряду с этим происходит гидролиз клеточных белков и нуклеиновых кислот, так как ну-клеазы и протеазы в данных условиях резистентны к мочевине [483]. Низкомолекулярные вещества из лизата удаляют при помощи диализа в течение суток против бидистиллированной воды Полного удаления мочевины можно достичь с помощью уреазы, [c.39]

Динер и Шнайдер [288] предложили быстрый и удобный однофазный метод выделения РНК из растительных вирусов и ДНК из вируса ЗУ40. Для ВТМ процедура сводится к тому что к 10—20 мг вируса в 1 мл 0,02 М фосфатного буфера, pH 7,0 добавляют 0,5 мл абсолютного этанола, затем смешивают с 1,5 мл раствора, содержащего 1 мл 90%-ного фенола и 0,5 мл этанола при 20 . Смесь выдерживают один час при О и центрифугируют при низкой скорости. Осадок, содержащий РНК, ресуспендируют в фосфатном буфере. Для удаления остаточного фенола РНК дважды осаждают этанолом и центрифугируют при 10 ООО g 10 минут для удаления денатурированного белка. Процесс деградации вирусной частицы до нуклеиновой кислоты занимает около часа и легко контролируется по этапам, В данном случае можно подобрать наименьшую концентрацию фенола при минимальных потерях нуклеиновой кислоты в процессе выделения. [c.164]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология