РАС pNS конструирование геномных

Геномные библиотеки и их конструирование [c.41]

Рис. 9. Космидный вектор и конструирование клонотеки геномной ДНК на его основе

Принципы геномного конструирования [c.433]

При соблюдении принципов геномного конструирования удается получить жизнеспособные гибриды даже между отдаленными фагами. Так были вьщелены гибриды фагов Я и Р22, которые, несмотря на сходство в строении геномов, отличаются следующими свойствами. [c.437]

Как видно из рис. 5-81, клоны геномной ДНК и клоны к ДНК существенным образом различаются. Геномные клоны представляют собой случайную выборку из всех нуклеотидных последовательностей ДНК данного организма. Состав геномной библиотеки не зависит от того, какой тип клеток был выбран для ее получения. В отличие от этого клоны к ДНК содержат лишь те участки генома, которые транскрибируются в мРНК. а так как в клетках разных тканей наборы синтезируемых молекул мРНК различны, то и библиотеки кДНК различны для разных типов клеток, используемых при их конструировании. [c.329]

Предлагаемый вниманию читателей сборник Анализ генома ПОД редакцией К. Дейвиса — еще одна книга из прекрасно зарекомендовавшей себя серии А Pra ti al Approa h . В ней описаны новейшие молекулярно-биологические методы переноса генов в клетках млекопитающих, рестрикционного картирования, конструирования библиотек прыжков , полимеразной цепной реакции и др. Иными словами, в эту книгу включены те методы, которые позволяют существенно продвинуться в понимании структуры и функционирования генома, разобраться в механизмах наследственных болезней человека. Особого внимания заслуживает материал, изложенный в двух последних главах. Одна из них (гл. 7) посвящена геномной дактилоскопии, методу, перевернувшему представления о возможностях судебно-медицинской экспертизы в другой (гл. 8) речь идет о картировании генов, ответственных за некоторые наследственные болезни человека, с помощью анализа ПДРФ-маркеров. Как всегда в книгах этой серии непосредственному описанию каждой методики предшествует краткое теоретическое введение, делающее ее понятной и начинающему аспиранту, и опытному исследователю. [c.5]

Этапы работы аналогичны тем, которые подробно описаны для стандартной геномной библиотеки. Здесь мы отметим лишь. различия. Хотя речь в этом разделе идет о конструировании с помощью рестриктазы Notl, данные, приведенные здесь, легко обобщить для специфических библиотек, получаемых на основе лругих редкощепящих ферментов. [c.114]

Очень трудно подобрать такие условия, чтобы большинство циклических молекул включило хотя бы по одному supF-reuy, особенно если размер молекул геномной ДНК сильно варьирует, как это бывает при конструировании библиотек прыжков с использованием редкощепящих рестриктаз. [c.119]

В этой главе мы подробно опишем методы, используемые нами в настоящее время для конструирования и скрининга космидных библиотек, а также для опытов типа прогулка вдоль хромосомы . Прогулка вдоль хромосомы определяется как метод, используемый для выделения фрагментов ДНК, соседних с данным районом клонированной ДНК. В большинстве случаев такая прогулка осуществляется с помощью скрининга геномных библиотек, полученных из частично гидролизованной ДНК, с использованием меченого уникального рестрикционного фрагмента, выделенного из концевой области клонированного района. Таким образом получают клоны, содержащие перекрывающиеся фрагменты ДНК, и после рестрикционного картирования и соответствующей ориентации фрагментов материал этих клонов может использоваться для продолжения такой прогулки . [c.17]

На рис. 9 представлена схема конструирования клонотеки геномной ДНК с использованием космидного вектора. Следует иметь в виду, что общие принципы получения клонотек генов приложимы и к любым другим векторам. На первом этапе конструирования осуществляют подготовку вектора и клонируемой ДНК. Космидный вектор расщепляют рестриктазами ВатШ и Smal, причем рестриктаза Smal расщепляет ДНК с образованием тупых концов. В результате образуются два плеча космидного вектора, содержащих область начала репликации ori, используемую системой репликации бактериальных клеток, и два селектируемых маркера, которые представляют собой гены устойчивости к антибиотикам - ампициллину (Атр ) и канамицину (КапО, а также два со -сайта хромосомы бактериофага X. Параллельно со всеми необходимыми предосторожностями получают препараты высокомолекулярной ДНК, которую необходимо клонировать. [c.156]

На вышеприведенном частном примере был рассмотрен один из подходов к конструированию клонотеки геномной ДНК с использованием космидного вектора, который иллюстрирует все основные этапы получения клонотек генов с применением и других векторов, плазмидных или фаговых [227, 228]. Во всех случаях для получения репрезентативных клонотек генов следует по-itiHHTb о необходимости случайной фрагментации клонируемой высокомолекулярной ДНК, чтобы все участки генома в образующейся смеси фрагментов были представлены равновероятно, роме того, размеры образуемых фрагментов ДНК должны соответствовать емкости вектора, используемого для их клонирования. Так, для клонирования в космидах необходимо получать фрагменты ДНК длиной 35-45 т.п.о., тогда как для клонирования в фаговых векторах типа haron и плазмидах эти размеры должны составлять соответственно 20-24 и 1,5-3,0 т.п.о. [c.157]

Таким образом, под контролем локуса МАТ находится иерархия регуляторных цепочек. Внутриклеточная транспозиция генов обеспечивает базальный уровень синтеза белков дифференциации, которые затем при наличии внещних сигналов приводят к завер-щению дифференцировки клеток. Этот пример наглядно демонстрирует сложность проблем, которые придется рещать экспериментатору при попытках геномного конструирования даже у одноюгеточных организмов. [c.138]

Фазмидные векторы так же как и фаговые, используют для клонирования кДНК и геномной ДНК. Эффективность упаковки рекомбинантных фазмид в фаговую головку с последующим инфицированием клеток Е. oh превосходит эффективность трансформации бактерий плазмидами в 100 раз. Это существенно облегчает конструирование банков генов, содержащих до миллиона независимых клопов, повышая тем самым вероятность изолирования редких клонов. И сам процесс скрининга в данном случае также существенно облегчен, так как рассев фагов на чашки может проводиться с высокой плотностью, а фон ложных ответов обычно мал (см. гл. 9). Однако большой размер фаговых и фазмидных векторов затрудняет рестрикционный анализ клонированных генов и их секвенирование, так что после нахождения [c.221]

Для получения полной или частичной геномной библиотеки проводят тотальное (валовое) клонирование всех выделенньгх фрагментов ДНК. Такой способ клонирования называют также щот-ган (shot-gun)-экспериментом. В случае же конструирования рекДНК, содержащей определенный ген с некоторыми известными характеристиками, фрагменты ДНК, получаемые под действием рестриктаз, разделяют с помощью электрофореза в агарозном или полиакриламидном гелях. Если размер фрагмента, несущего нужный ген, неизвестен, его находят методом гибридизации по Саузерну (см. приложение). Для этого разделенные фрагменты ДНК переносят из геля на нитроцеллюлозный фильтр, гибридизуют с радиоактивным РНК- или ДНК-зондом к нужному гену и подвергают авторадиографии. След на рентгеновской пленке указывает на положение искомого фрагмета ДНК в геле. Этот фрагмент [c.241]

Клонирование. Из данных табл. 9.1 видно, что для составления представительной геномной бибпиотеки необходимо собрать большое число клонов, достигающее для высших эукариот нескольких сотен тысяч и даже миллионов. Подчеркнем, что речь идет о клонах, содержащих рекДНК. Отсюда понятно, почему в системах клонирования, предназначенных для конструирования гаких библиотек, серьезное внимание уделяется проблеме прямой селекции подобных клонов. Ни один из методов не абсолютен. По этой причине стараются поставить, как минимум, два барьера против l Jтoнoв, не содержащих рекДНК. Одним из таких барьеров слу жит ограничение размера ДНК при ее упаковке в фаговые головки. Поэтому часто применяют векторы, сконструированные на базе ДНК фагов Л и Р1. [c.273]

Целенаправленное конструирование новь х гзномгв требует з..анкя их структуры, понимания принципо их организации, а такхсе > чета механизмов взаимодействия генов и их продуктов В свою очередь одним из методов исследования этих аспектов может служить геномная инженерия. [c.432]

Природе также не чужда стратегия геномного конструирования. Так, результатом природной гено1чной инженерии вирусов, вызывающих фипп, являются его с 11 -гые эпидемии, происходящие приблизительно каждые восе1У". /. т. Дело в том, что геном этих вирусов состоит из восьми различных фрагментов РНК, со- [c.432]

В настоящее время геномная инженерия находится в стадии накопления экспериментального материала. Тем не менее на основе достижений молекулярной биологии и генетики можно сформулировать некоторые общие принципы геномного конструирования, которые справедливы, по крайней мере, для плазмид, вчрусов и однокле "очных организмов. [c.433]

К продуктам геномной инженерии можно отнести также космиды, фагмиды, дрожжевые и другие челночные векторы. Но наиболее последовательное использование принципов геномного конструирования можно проследить на С к- ериофагах. [c.434]

Геномное конструирование можно проютлюстрировать на примере гибридов лямбдоидных фагов X и ф80 (см. гл. 4). У этих фагов генетические карты сходны (рис. 14.1), гены, занимающие одинаковые места, выполняют аналогичные функции, а геномы обладают тремя характерными особенностями. [c.434]

Проиллюстрируйте на примере гибридов лямбдоидных бактериофагов принципы геномного конструирования. [c.439]

Гены, встраиваемые в ретровирусный вектор с собственным промотором, могзгг содержать сигналы терминации транскрипции, что при совпадении направления транскрипции целевого гена и провируса приведет из-за преждевременной терминации к нарушению синтеза полноразмерной геномной РНК. Такие сигналы нужно удалять на стадии конструирования гибридной ДНК либо ориентировать чужеродный [c.408]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология