Геномная РНК и ее продукты

Для идентификации нужного гена человека используют четыре метода. В первом из них, функциональном картировании, на основе данных о генном продукте синтезируют зонды для скрининга кДНК-библиотеки. Положительный кДНК-клон, содержащий кодирующую область гена-мишени, используют для отбора геномных клонов и характеристики гена в целом. Второй подход, кандидатное картирование, основывается на выборе генов, которые по имеющимся [c.480]

Зонды для скрининга геномной библиотеки можно получить по крайней мере двумя способами. Во-первых, можно использовать клонированную ДНК близкородственного организма (гетерологичный зонд). В этом случае условия гибридизации нужно подбирать таким образом, чтобы она могла происходить при существенном расхождении между нуклеотидными последовательностями зонда и искомой ДНК это позволяет решить проблемы, связанные с заведомым различием между ДНК - источником зонда и исследуемой ДНК. Во-вторых, зонд можно получить методом химического синтеза, основываясь на известной аминокислотной последовательности белкового продукта искомого гена. [c.67]

Позиционно-кандидатное картирование состоит в определении хромосомной локализации гена болезни, продукт которого неизвестен, и последующем анализе современных генетических и транскрипционных карт, с тем чтобы выявить кодирующие последовательности (гены, внутригенные EST), находящиеся в этом же районе (рис. 20.30). Весьма вероятно, что одна из этих последовательностей и окажется геном данного заболевания. Если какой-либо из генов-канди-датов охарактеризован, можно провести его мутационный анализ. Как альтернативу можно использовать кандидатные EST в качестве зондов, отобрать с их помощью геномный клон и секвенировать его, а затем также провести му- [c.476]

Те клетки на чашке, которые соответствуют окрашенным пятнам на фильтре, содержат или полноразмерный ген, или достаточно протяженный его участок, обеспечивающий синтез белкового продукта, узнаваемого первыми антителами. По окончании иммунологического скрининга геномной библиотеки необходимо определить, какой именно из отобранных клонов содержит полноразмерный ген. [c.68]

Иммунологический скрининг В отсутствие ДНК-зонда для скрининга геномной библиотеки можно использовать другие методы. Например, если клонированный ген экспрессируется, то его продукт - весь белок или его часть - можно обнаружить иммунологиче- [c.67]

Генетическое картирование ставит своей конечной целью определение нуклеотидной последовательности гена и прилегающих к нему участков вплоть до соседних генов. Для этого нужно прежде всего выделить ДНК, соответствующую данному гену. Сначала это сделали на вирусах, у которых легко выделить всю геномную ДНК. С тех пор, однако, выделение любого типа клеточной ДНК стало почти общедоступной процедурой в том случае, если есть соответствующий белковый продукт (хотя при малом количестве белка выделение специфической ДНК может занять довольно много времени). [c.43]

Одна из стратегий идентификации гена заболевания в отсутствие данных о продукте этого гена и каких-либо генов-кандидатов. В подобных случаях сначала определяют хромосомную локализацию (позицию) гена. Затем получают геномные клоны, охватывающие картированный сайт (используя соответствующие маркеры), идентифицируют и анализируют присутствующие в них экзоны. Используя целый ряд методов (идентификация G -островков, улавливание экзонов, секвенирование, компьютерный анализ и т.д.), определяют, какой именно ген ответствен за данное заболевание. [c.556]

Искусственные дрожжевые хромосомы (YA ) предназначены для клонирования больших фрагментов ДНК (100 т. п. н.), которые затем поддерживаются в дрожжевой клетке как отдельные хромосомы. УАС-система чрезвычайно стабильна. С ее помощью проводили физическое картирование геномной ДНК человека и анализ больших транскриптонов, создавали геномные библиотеки, содержащие ДНК индивидуальных хромосом человека. YA -вектор напоминает хромосому, поскольку он содержит последовательность, функционирующую как сайт инициации репликации ДНК (автономно реплицирующуюся последовательность), сегмент центромерной области дрожжевой хромосомы и последовательности, образующиеся на обоих концах при линеаризации ДНК и действующие как теломеры, обеспечивающие стабильность хромосомы (рис. 7.3). При встраивании чужеродной ДНК в YA может происходить нарушение рамки считывания маркерного дрожжевого гена. В результате продукт этого гена не образуется, и при выращивании клеток на специальной среде можно наблюдать цветную реакцию. Кроме того, некоторые YA -векгоры несут селективный маркер, независимый от сайта клонирования. Несмотря на все преимущества, YA пока не использовались для промышленного синтеза гетерологичных белков. [c.137]

Половое размножение большинства высших организмов характеризуется следующими важнейшими чертами 1) продуцирование гамет в результате мейоза 2) рекомбинация элементов генома путем кроссинговера (см. разд. 2.1.2) 3) случайное распределение гомологичных хромосом по всем продуктам мейоза (см. разд. 2.1.1) 4) создание новых особей в результате сингамии (слияние двух гамет, обычно от двух отдельных особей). Благодаря этим процессам половое размножение может порождать значительные геномные различия между родительскими особями и их потомками, даже в отсутствие мутационного процесса. Этот способ размножения широко распространен, встречается по всему животному миру и, вероятно, возник очень давно. [c.79]

Естественно, что помимо субгеномных (+)РНК одним из продуктов репликации / транскрипции должны быть и полноразмерные (геномные) (+)РНК, которые, во-первых, направляют синтез белков, закодированных в 5 -концевом районе генома, а во-вторых, включаются в дочерние вирусные частицы. Полноразмерные (-Н)РНК считываются с такой же (—)матрицы, как и субгеномные мРНК- Динамика образования различных видов вирус-специфических РНК различна синтез (—)РНК более характерен для ранних стадий инфекционного цикла, а синтез (+)РНК — для поздних обнаруживаются и различия в динамике синтеза субгеномных и полноразмерных (+)РНК. Известно, что в этой регуляции принимают участие вирус-специфические белки, но конкретные их функции пока не выяснены, если не считать, что некоторые из них входят в состав РНК-зависимой РНК-полимеразы. [c.323]

Для идентификации трансформированных клеток необходимо уметь обнаруживать чужеродную ДНК, интегрировавшую в геномную ДНК растения. Более того, при исследовании сигналов регуляции транскрипции и их функций в специфических растительных тканях (листьях, корнях или цветках) зачастую важно уметь количественно оценивать уровень экспрессии гена, кодирующего легко идентифицируемый продукт. Все это требует применения репортерных генов, которые позволяют либо проводить отбор трансформированных клеток, либо оценивать активность кодируемого ими фермента. Было протестировано несколько разных генов, которые можно использовать как доминантные селективные маркеры, и генов, чей белковый продукт можно обнаружить с помощью специфических методов (табл. 17.4). Поскольку многие из ренортерных генов имеют бактериальное происхождение, они были снабжены регуляторными последовательностями, обеспечивающими их экспрессию в растительных клетках. Проводя отбор по доминантному маркеру, можно получить культуру, содержащую только трансформированные клетки. Так, в присутствии канамицина выживают только клетки растений, синтезирующих активную неомицинфосфо-трансферазу. [c.381]

В том случае, если в каждом праймере содержатся рестрикционные сайты, клонируют ПЦР-продукт, несущий пойманный экзон, и используют последний в качестве зонда для скрининга кДНК-библиотеки. Зная нуклеотидную последовательность пойманного экзона, предпринимают поиск гомологичных ему последовательностей в базе данных. Если есть основания полагать, что пойманный экзон с большой вероятностью является частью гена данного заболевания, то характеризуют и секвенируют геномные клоны, охватывающие место расположения данного гена, и исследуют образцы ДНК больных и здоровых индивидов с целью выявления мутаций. Поскольку мутации, ответственные за патологию, не всегда бывают равномерно распределены по всем экзонам, чем больше размер сканированной кодирующей области предполагаемого гена, тем больше вероятность обнаружения мутации. [c.476]

В этой главе мы рассмотрим первые этапы исследования индивидуальных генов. Как выделить цитоплазматическую РНК или геномную ДНК, соответствующую определенному гену Как, идентифицировав такую ДНК, получить ее в достаточном для исследования количестве Можно ли использовать этот материал для синтеза продукта гена in vitro или in vivo Можно ли вносить в полученную последовательность изменения, влияющие на ее экспрессию и способствующие выяснению природы регуляторных сигналов [c.236]

TOB точно соответствуют размерам сегментов ДИ РНК. Трапс-крипты ДИ РНК также содержат поли (А) (длиной в 60—350 нуклеотидов) на З -конце и АрГ праймер на 5 -конце [17]. Гибридизация транскриптов ДИ РНК с соответствующими сегментами ДИ РНК и анализ дуплексов РНК показал, что ДИ РНК-специ-фические транскрипты не являются неполными продуктами гена полимеразы, а представляют собой точные копии ДИ РНК. Эти результаты прямо показывают, что ДИ РН К транскрибируются в поли (А)-содержащие комплементарные РНК, которые имеют характеристики стандартных геномных транскриптов. [c.268]

Если при амплификации геномной ДНК позвоночных в качестве праймеров для ПЦР используют олигонуклеотиды длиной 20 нуклеотидов и более, то процесс этот довольно специфичен и амплифицируется только один фрагмент ДНК- Однако иногда среди продуктов реакции наблюдается накопление фрагментов, происхождение которых трудно объяснить. А поскольку эти фрагменты могут мешать последующему анализу (РНКазному расщеплению, ДГГЭ, секвенированию), то рекомендуется провести еще одну серию амплификаций, с использованием другого набора олигонуклеотидных праймеров. Этот метод, именуемый nested oligo [22], состоит в следующем продукт первичной полимеразной цепной реакции используется в качестве матрицы в последующих раундах ПЦР, но уже с двумя другими олигонуклеотидами, имеющими гомологии с участками ДНК внутри первичного амплифицированного фрагмента (рис. 6, Б). Такая процедура позволяет получить большое количество индивидуальной последовательности ДНК, несколько более короткой, чем исходный фрагмент, и использовать ее для последующего анализа. [c.139]

Примерно десятую часть продуктов реакции амплификации исследуйте при помощи электрофореза в агарозном геле. Во многих случаях получается одна полоса, окрашенная бромистым этидием. Можно даже примерно рассчитать количество амплифицированной ДНК- Обычно при амплификации последовательности длиной 1 т. п. н. из 0,3 мкг геномной ДНК млекопитающих получают 1 мкг амплифицированной последовательности. При амплификации маленького фрагмента ДНК последовательно с двумя парами праймеров (внутренних и внешних) можно получить несколько микрограмм такого внутреннего фрагмента. Иногда в геле обнаруживаются дополнительные полосы, происхождение которых неизвестно. Однако они не мешают анализу специфических фрагментов методом РНКазного расщепления или ДГГЭ. При использовании метода nested oligo такие полосы не появляются. [c.144]

Поскольку в результате цепной амплификации образуются идентичные фрагменты специфичной ДНК, сразу же может быть осуществлено клонирование или секвенирование продуктов реакции. Матрицей для ПЦР-амплификации могут служить как геномная ДНК, так и кДНК, синтезированная путем обратной транскрипции РНК- Чувствительность метода позволяет обнаружить и амплифицировать единственную молекулу ДНК. При ЦР и наличии нерадиоактивных материалов полимеразная цепная реакция обещает стать в будущем стандартной молекулярно-биологической процедурой. Можно предположить, что велика будет и ее роль в диагностике наследственных и инфекционных заболеваний. [c.189]

Обратная трансляция аминокислотной последовательности Met-Phe-Asn- ys-Trp указывает на необходимость синтеза 15-звенного вырожденного олигонуклеотида со следующей первичной структурой ATGTT(T/ )AA(T/ )TG(T/ )TGG, в которой нуклеотиды в скобках отмечают места с неоднозначной последовательностью. Теоретически олигонуклеотид длиной в 14-15 нуклеотидов, полученный путем обратной трансляции последовательности из пяти аминокислотных остатков должен быть уникальным для геномов такого размера, как геном человека. Впрочем, это утверждение верно лишь в том случае, если геном представлен случайной последовательностью. На практике это не так. В любом большом геноме встречаются мультигенные семейства с близкой первичной структурой, и наблюдается гомология между многими последовательностями, которая отражает их зависимое друг от друга происхождение. Поэтому 15-звенный олигонуклеотид при исследовании генома человека скорее всего не окажется геноспецифическим. Однако извлечь специфическую геномную последовательность с помощью таких олигонуклеотидов можно при использовании их в качестве праймеров для ПЦР на матрице кДНК соответствующей клонотеки. В этом случае неспецифические олигонуклеотиды скорее всего не будут участвовать в образовании продукта ПЦР. [c.165]

Целенаправленное конструирование новь х гзномгв требует з..анкя их структуры, понимания принципо их организации, а такхсе > чета механизмов взаимодействия генов и их продуктов В свою очередь одним из методов исследования этих аспектов может служить геномная инженерия. [c.432]

Все гены организма можно разделить на облигатные и фа-ю льтатирные, т. е. на обязательные и необязательные для выживания организма в заданных условиях (или воспроизводства плазмид и вирусов в клетке). Чтобы продукт геномной инженерии Сыл жизнеспособным, его геном должен содержать все облигатные гены. [c.433]

К продуктам геномной инженерии можно отнести также космиды, фагмиды, дрожжевые и другие челночные векторы. Но наиболее последовательное использование принципов геномного конструирования можно проследить на С к- ериофагах. [c.434]

Смотреть страницы где упоминается термин Геномная РНК и ее продукты: [c.228] [c.142] [c.194] [c.473] [c.480] [c.549] [c.180] [c.205] [c.251] [c.46] [c.504] [c.333] [c.335] [c.276] [c.277] [c.482] [c.127] [c.140] [c.127] [c.140] [c.48] [c.252] [c.275] [c.403]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология