сайты рестрикции хромосомы

Рис. 20.11. Использование рестрикционных сайтов в качестве генетических маркеров. А. Замена одной пары нуклеотидов в рестрикционном сайте приводит к тому, что рестриктаза не распознает его и не расщепляет ДНК. Интактный и измененный сайты рестрикции отмечены знаками (+) и (—) соответственно. Б. Участок одной хромосомы, содержащий три сайта (А, 1 и В), узнаваемые одной и той же рестриктазой. X - расстояние между сайтами А и 1, У - расстояние между сайтами 1 и В, X + У -расстояние между сайтами А и В. Сайты А и В во всех случаях интактны (оба +), а сайт 1 может быть как интактным (+), так и измененным (-). Если сайт 1 интактен (+), то после обработки ДНК рестриктазой образуются фрагменты X и У. Если же он изменен (—), то образуется единственный фрагмент (X + V). Если провести блот-гибридизацию по Саузерну с зондом а, то мы обнаружим фрагмент X в том случае, если сайт 1 интактен (+), и фрагмент (X + V), если он изменен (-). В. Фрагменты, образующиеся после обработки рестриктазой, и фрагменты, выявляемые при гибридизации по Саузерну с зондом а, для каждого из генотипов (+/+, +/-, -/-). Г. Фрагменты одной хромосомы, образующиеся после обработки рестриктазой, и фрагменты, выявляемые при гибридизации с зондом Р или у.

Появившиеся в последнее время методы позволяют составлять подробные карты очень больших геномов. Есть две категории карт 1. Физические карты, основывающиеся на строении молекул ДНК, составляющих каждую хромосому. Сюда относятся рестрикционные карты и систематизированные библиотеки клонов геномной ДНК. 2. Карты генетического сцепления их строят, основываясь на частоте совместной передачи потомству двух или нескольких признаков - генетических маркеров, различных у отца и матери и приписываемых определенному участку хромосомы. В качестве маркеров издавна принято использовать те гены, экспрессия которых обнаруживается по их эффекту (таковы, в частности, гены, вызывающие генетические болезни, например мышечную дистрофию). Разработанные сравнительно недавно новые методы с применением рекомбинантной ДНК дали возможность использовать в качестве генетических маркеров короткие последовательности ДНК, содержащие один из сайтов рестрикции и различающиеся у отдельных индивидуумов, такие последовательности особенно удобны для генетического картирования, потому что под действием рестрикционной нуклеазы возникают фрагменты, различающиеся по своей длине, и этот полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) легко может быть выявлен блот-анализом по Саузерну с помощью подходящего ДНК-зонда (рис. 5-90). [c.342]

Типы полиморфизма ДНК. Наиболее распространенный тип полиморфизма ДНК-рестрикционный полиморфизм. Если в сайте узнавания для какой-то рестриктазы происходит точечная мутация, фермент не распознает свой сайт и не разрезает ДНК (рис. 2.84). Имея под рукой специфические ДНК-зонды и рестриктазы, можно анализировать ДНК. Рестрикционные фрагменты ДНК (рестрикты) различаются по длине (полиморфизм по длине рестрикционных фрагментов). Они идентифицируются по различной подвижности после гибридизации по Саузерну (рис. 6.5). В настоящее время метод гибридизации по Саузерну включает радиоактивное мечение. Вероятно, в будущем появится возможность нерадиоактивного мечения фрагментов ДНК. Точечные мутации, заменяющие один нуклеотид на другой в некодирующем районе ДНК, встречаются очень часто. Немногие систематические исследования изменчивости ДНК проводились путем анализа с использованием большого количества рестриктаз в небольшой выборке особей (10 12). Результаты, полученные для хорошо изученных к настоящему времени областей генома (гемоглобина, альбумина и сегментов ДНК с неизвестной функцией из разных хромосом) [1143 1742 1959], свидетельствуют о том, что уровень нуклеотидной изменчивости приблизительно на порядок выше, чем наблюдаемый по структурным генам, кодирующим белки. Это означает, что разница между случайно выбранными хромосомами составляет в среднем 75оо" 7г5о нуклеотидов (гетерозиготность = = 0,001 — 0,004). Особенно подходят для выявления вариантов ДНК ферменты Мер и Тая1, узнающие метилированный динуклеотид СрО. Большинство вариантов по длине рестрикционных фрагментов диморфны, т. е. имеют только два аллеля -присутствие ( + ) или отсутствие ( —) сайта рестрикции. Частота полиморфного ва- [c.288]

Используя метод Саузерна при сравнении нормальных мух и мух, в геноме которых имеются делеции, можно локализовать концы этих делеций, если использовать в качестве зонда клонируемую ДНК. О нарушении нормальной нуклеотидной последовательности в делетирован-ной хромосоме свидетельствует изменение распределения сайтов рестрикции по сравнению с ДНК нормальной хромосомы. Например, если конец делеции находится между двумя сайтами рестрикции нормальной ДНК, то расстояние между оставшимся сайтом и следующим (внутри делеции) изменится, поскольку почти наверняка следующий сайт в делеции окажется на другом расстоянии от сохранившегося, чем был первый. На рис. 9.18 показано использование метода Саузерна для определения нового распределения сайтов рестрикции. [c.283]

Прогулка по хромосоме -это инструмент, позволяющий систематически картировать хромосомы эукариотических организмов. Обсуждав-щиеся в этой главе методы работы с ДНК-клонирование рестрикционных фрагментов, анализ сайтов рестрикции в клонируемой ДНК, метод Саузерна, использование клонируемой ДНК в качестве радиоактивного зонда при гибридизации с другими фрагментами ДНК-дают возможность использовать мощные методы генетического анализа, разработанные на прокариотических организмах, для исследования генетической организации эукариот на уровне нуклеотидных последовательностей. Применение этих методов привело к колоссальному прогрессу в нащих знаниях об организации, функционировании и эволюции геномов эукариот. Некоторые из этих открытий мы подробно обсудим в следующих главах, о других можно прочитать в научных журналах. [c.288]

Полиморфизм ДНК и картирование. В последние годы выявляется все больше случаев полиморфизма ДНК по сайтам рестрикции (разд. 2.3.2.7, 6.1.2). Это обстоятельство раскрыло новые дополнительные возможности картирования генома человека. Установление тесного сцепления с рестрикционным маркером ДНК позволило локализовать гены многих важных наследственных болезней в конкретных хромосомных сегментах. На рис. 3.24, А представлена большая родословная с хореей Гентингтона. ДНК-маркер и, следовательно, ген хореи расположены на хромосоме 4. Модельные расчеты [584 754 887] показали, что для картирования всего генома необходимо лишь несколько сотен рестрикционных маркеров ДНК, случайным образом распределенных по геному человека. Для целей медико-генетического консультирования и пренатальной диагностики (разд. 9.1) достаточен по крайней мере один маркер, тесно сцепленный с геном данного наследственного заболевания. [c.202]

Рис. 6.6. Вариант ДНК может возникнуть из-за различной длины тандемных повторяющихся последовательностей. Последовательности Л, Б, В и Г различаются на один повторяющийся сегмент таким образом, последовательность А имеет 6 повторов, а Г-3 повтора. Сайты рестрикции отмечены стрелками. Эти сайты не изменяются. Однако размер фрагментов ДНК варьирует в зависимости от числа повторов. Наименьшая хромосома Г будет двигаться быстрее различные размеры ДНК при гибридизации по Саузерну различаются по миграционной подвижности. Гетерозиготы по различным комбинациям показаны схематически (А/Б, Б/В и т. д.) [60].

Очень эффективным могло бы оказаться создание геномной библиотеки третьего типа, имеющей в своем составе клоны, соединяющие редко встречающиеся сайты рестрикции с прилегающими случайными последовательностями ДНК генома. Имея такую библиотеку, мы могли бы начинать движение по хромосоме с любой стартовой точки, а при встрече с редким сайтом рестрикции пускать в ход специфическую геномную библиотеку. К сожалению, пока эта задача не решена и подходы к ее решению здесь обсуждаться не будут. [c.99]

Анализ реальных образцов ДНК несколько более сложен, поскольку хромосомы встречаются парами (рис. 20.11, В). Однако и в этом случае каждому генотипу (+/+, +/-, -/-) соответствует определенный набор фрагментов, образующийся в результате гибридизации с зондом. Кроме того, для выявления сайта рестрикции на участке 1 можно использовать зонды, гибриди-зующиеся с другими участками ДНК между сайтами А и В (рис. 20.11, Г). Феномен, состоящий в том, что наличие часто встречающегося в популяции измененного рестрикционного сайта приводит к образованию специфического набора фрагментов ДНК, называют полиморфизмом длины рестрикционных фрагментов (НДРФ). Полиморфные сайты рестрикции образуют маркерные локусы на той хромосоме, где они присутствуют. [c.453]

Рестрикционный анализ ДНК позволяет выявить различия в отдельных нуклеотидных парах, появляющиеся в результате мутаций в сайтах, узнаваемых соответствующим ферментом. В случае серповидноклеточной анемии происходит замена АТ на ТА в шестой паре нуклеотидов гена, кодирующего Р-цепь гемоглобина человека замена происходит в сайте (СТКАО), чувствительном к рестриктазе Ойе (рис. 9.19). Фрагменты ДНК, возникающие под действием Ос1е1 у здорового человека и больного серповидноклеточной анемией можно сравнить с помощью метода гибридизации по Саузерну, используя в качестве зонда радиоактивно меченную ДНК гена Р-глобина, как это показано на рис. 9.19. Таким способом можно определять присутствие вредного мутантного гена в геноме эмбриона за несколько месяцев до рождения. Для этого культивируют зародышевые клетки, взятые при амниоцентезе. ДНК этих клеток экстрагируют и подвергают анализу. Такая диагностическая процедура может производиться в тех случаях, когда существует подозрение, что оба родителя-носители вредного рецессивного гена. Следует заметить, что в большинстве случаев вредные мутации происходят вне сайтов, узнаваемых рестриктазами. Однако иногда такие мутации оказываются в хромосомах тесно сцепленными с сайтами рестрикции, что может во многих случаях использоваться в пренатальной диагностике. [c.288]

Рис. 5-90. Выявление полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) блот-анализом по Саузерну Для простоты в хромосомах показано лишь несколько сайтов рестрикции, хотя в действительности их многие тысячи. Если до воздействия рестрицируюшей нуклеазой провести амплификацию соответствуюш,его участка методом ПЦР, этот же тест можно провести без радиоизотопов и от блот-анализа отказаться

Выявление биохимических вариантов позволит увеличить число информативных семей. Для выявления биохимических вариантов можно использовать маркеры, принадлежащие к любым полиморфным системам. Как было показано выше, в случае Х-хромосомы учитывали полиморфизм по цветовой слепоте и по группе крови Xg. Описанный подход имеет то преимущество, что он основан на данных о точно идентифицированных аллелях, частоты которых известны. Недавно был получен ДНК-зонд, специфичный для 21-й хромосомы и пригодный для выявления полиморфизма по сайтам рестрикции (ПДРФ). При изучении 25 человек из популяции Лондона частота более редкого аллеля оказалась равной 0,38, а частота гетерозигот-0,47 [1433]. [c.152]

С появлением методологии генной инженерии метод локализованного мутагенеза становится доступным для широкого круга микроорганизмов. В наиболее простом варианте клонированный фрагмент ДНК, ограниченный удобными сайтами рестрикции, может быть выделен и подвергнут мутагенезу in vitro. Вследствие проведения реакции in vitro дозы мутагена могут быть достаточно высокими, что сильно повышает частоту мутагенеза. Такой подход использован при создании штамма-продуцента гомосерина (см. гл. 4). Для получения стабильных неревер-тирующих мутаций в определенном гене можно применить метод инсерционного локализованного мутагенеза. С этой целью инактивируемый ген клонируют на плазмиде и встраивают в него детерминант устойчивости к антибиотику (рис. 29). Затем компетентные клетки трансформируют сконструированной гибридной плазмидой (или полученной при ее расщеплении линейной молекулой ДНК), содержащей указанный детерминант, фланкированный последовательностями, гомологичными хромосомному гену. В результате двойного кроссинговера происходит интеграция гена лекарственной устойчивости в гомологичный район хромосомы. Искомые трансформанты отбирают на селективных [c.160]

Следует разграничить понятия стандартных геномных библиотек для прыжков по хромосоме [3—5, 15] и специфических библиотек [4, 5, 16]. В первом случае библиотеки создаются таким образом, что начинать движение вдоль хромосомы отмеренными прыжками можно в принципе с любой точки генома. Специфические библиотеки состоят из клонов, позволяющих осуществлять прыжки от одного редко встречающегося сайта рестрикции, например Notl, к последующему такому же сайту. Типьв прыжков схематически изображены на рис. 3. Очевидно, что [c.98]

Рис. 3. Схема, иллюстрирующая различные типы прыжков по хромосоме , А — клоны стандартных библиотек, позволяющие осуществлять строго определенные прыжки, начиная от любой точки на хромосоме. Б — два клона специфических библиотек, в данном случае для фермента Они позволяют осуществлять прыжки от одного сайта этого фермента к ближайшему такому же сайту. В — клоны библиотек связок , представляющие собой участк ДНК, которые включают редко встречающиеся сайты рестрикции, в данном случае Л оЛ-сайты. Г — клоны стандартной библиотеки, позволяющие осуществлять прыжки от произвольной точки до ближайшего редкого сайта рестрикции, в данном случае тоже до Л оЛ-сайта.

Для создания же полных специфических библиотек требуется всего лишь 10 000—20 000 клонов, так как количество независимых клонов эквивалентно числу рестрикционных фрагментов, полученных при использовании данного фермента рестрикции. Так например, для рестриктазы Notl, которая отщепляет приблизительно по 1000 т. п. н. в геноме человека, таких фрагментов должно быть всего лишь около 3000. Поэтому библиотеку из 10000 клонов для прыжков по Not 1-сайтам можно считать практически полной. Очевидным недостатком таких библиотек является то, что их нельзя использовать, когда стартовая точка прыжка не примыкает к редко встречаюш,емуся сайту рестрикции. К сожалению, это довольно частое явление, препятствуюш ее быстрому распространению данного метода. Если же все-таки удается идентифицировать клон, примыкающий к редко встречающемуся сайту рестрикции, использование специфических библиотек для прыжков по хромосоме может оказать неоценимую помощь. [c.99]

В случае же использования вирР-г на с дополнительными вставками редко встречающихся сайтов рестрикции (см. рис. 6) разделение половинок фрагмента, составляющего прыжок, упрощается, и зонды можно получать непосредственно из ми нилизата фаговой ДНК. После того как установлено что фрагмент- пры-жок представлен в геноме единичной копией, надо провести его гибридизацию с блотом геномной ДНК из гибридных соматических клеток, чтобы убедиться, что прыжок осуществлен в пределах нужной хромосомы. Это очень важный момент, так как при создании геномной библиотеки всегда существует опасность нециклического лигирования. [c.113]

Р С. 10-20. Рестрикционная карта й) для области хромосомы, несущей ген, который вызывает заболевание, и результаты рестрикции ДНК (Б) от разных членов семьи (задача 10-31). Полиморфные сайты обозначены А, В и С. Числа означают размеры фрагментов в I. п. н. Кружками обозначены женщины, квадратами-мужчины и треугольником-неродившийся [c.187]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология