Панкреатическая ДНКаза

С помощью обратной транскриптазы можно синтезировать копию любой части мРИК, выбрав для этого подходящий праймер. Эта возможность облегчает анализ строения какого-либо специфического участка гена. Но можно получить и набор генных фрагментов, если использовать в качестве праймеров произвольные олигонуклеотиды, получаемые, например, в результате гидролиза ДНК тимуса теленка панкреатической ДНКазой. Их разнообразие столь велико, что среди них имеются комплементарные последовательности к любому из участков мРИК (или ДНК). Добавление в реакционную смесь суммарной фракции таких праймеров дает возможность получить в наборе J HK копии всех участков анализируемого гена. Они полезны для использования их в качестве гибридизационных зондов, применяемых для поиска определенных клонов в банках генов (см. гл. 9). [c.182]

Другим способом введения метки в ДНК in vitro, который находит все более широкое применение, является ник-трансляция [15, 37, 48, 50]. В этом случае сначала ДНК инкубируют с панкреатической ДНКазой I, под действием которой в ДНК образуются одноцепочечные разрывы. Затем ДНКазу инактивируют, а ДНК инкубируют с полимеразой I Е. oli и натриевыми солями четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (один из которых является радиоактивным, обычно с меткой Н). [c.135]

КФМ эффективно применялся для изучения ДНК с разрывами, вызванными панкреатической ДНКазой, к изучению ДНК, подвергшейся ультрафиолетовому облучению, и т. д. Нативная, интактная, ДНК оказалась практически лишенной дефектов или слабых точек , что опровергает зигзагообразную модель нативной ДНК с резкими изломами и позволяет допустить справедливость червеобразной модели, в которой гибкость цепи определяется малыми поворотами в мономерах. КФМ применим к изучению комплексов ДНК с РНК-полимеразой (см. стр. 565), к изучению тонкой структуры ДНК [131, 132]. [c.526]

Рис 9-51 Обработка хроматина панкреатической ДНКазой I. Вначале фермент разрезает сайты обладающие повышенной чувствительностью к нуклеазе (не показано), затем деградации подвергается последовательность ДНК, в которую входят активно [c.129]

Пример 13-В. Соотношение кольцевой и линейной форм в молекулах ДНК. В 1961 г. было показано, что генетическая карта фага Т2 Е. oli циклична. Поскольку в то время не представлялось возможным наблюдать ДНК в электронный микроскоп для того, чтобы оцепить кольцевую форму, исследовали изменение Т1г единичного образца ДНК фага 12, который непрерывно обрабатывался панкреатической ДНКазой. Этот фермент вызывает одноцепочечные разрывы фосфоэфирных связей, которые накапливаются и в конце концов совпадают таким образом, что образуются двухцепочечные разрывы (рис. 13-9,Л). Эти одноцепочечные разрывы сами по себе не оказывают влияния на вязкость ДНК (рис. 13-9, ) вследствие того, что жесткость молекулы поддерживается стэкинг-взаимодействием оснований (гл. 16). Следовательно, для линейной молекулы т1отп постоянна в течение всего периода, когда образуются только одноцепочечные разрывы, и уменьшается благодаря уменьшению молекулярной [c.375]

I960)] или панкреатической ДНКазы с последующей обработкой диэстеразой змеиного яда. [c.80]

Нативная ДНК для панкреатической ДНК-азы служит более пригодным субстратом, чем денатурированная. Она действует на двухцепочечную ДНК,вызывая разрывы фосфодиэфирных связей в одной из полинуклеотидных цепей. Панкреатическая ДНКаза совершенно не чувствительна к малым олигонуклеотидам, апуриновым кислотам и к дезаминированным одноцепочечным ДНК. Под ее влиянием частично разрушаются некоторые биосинтетические полимеры. [c.65]

Состав продуктов гидролиза нуклеиновых кислот зависит от условий проведения реакции. Нагревание РНК или ДНК при 100X в 70%-ной хлорной кислоте приводит к образованию азотистых оснований [7], тогда как при действии на РНК соляной кислоты образуются пуриновые основания и пиримидиновые нуклеотиды [8], а щелочной гидролиз РНК дает смесь 3 - и 5 -рибонуклеотидов. В случае ферментативного расщепления нуклеиновых кислот состав продуктов определяется типом использованной нуклеазы. Например, РНКаза Тг расщепляет молекулу РНК до З -рибонуклеотидов [10], а при последующем действии фосфодиэстеразы из змеиного яда образуются нуклеозиды [11]. Аналогичным образом последовательная обработка ДНК панкреатической ДНКазой I и фосфодиэстеразой из змеиного яда приводит к образованию 5 -дезоксирибонуклеотидов [c.163]

Дезоксирибонуклеазы можно обнаруживать так же, как и рибонуклеазы. Бойд и Митчелл, [156] добавляли к акриламиду субстрат (нативную или денатурированную ДНК) перед полимеризацией геля. После электрофореза гели инкубировали и окрашивали присутствующую в них ДНК метиловым зеленым. Этот метод позволяет обнаружить 250 пг панкреатической ДНКазы. При сканировании гелей на денситометре при длине волны 260—265 нм окрашивание гелей можно не проводить [155]. [c.294]

Для локализации эндодезоксирибонуклеазной активности Грдина и др., [471] разработали чувствительный метод, позволяющий определять 5 пг панкреатической ДНКазы I. В качестве субстрата в полиакриламидный гель включали 7 мкг/мл ковалентно замкнутой двухцепочечной ДНК или открытой кольцевой ДНК. Электрофоретическое разделение проводили при pH 8,9. После электрофореза гели инкубировали в охлажденном 0,1 М буфере трис-НС1 (pH 7,0), содержащем 0,005 М Mg b. Затем [c.294]

Дезоксирибонуклеаза I (панкреатическая ДНКаза) Фермент обладает эндонуклеазной активностью по отношению к одно- и двунитевой ДНК. Это позволяет с его помощью гидролизовать до MOHO- и олигонуклеотидов любые препаратк ДНК. В присутствии I.OHOB магния ДНКаза атакует каждую нить ДНК независимо поэтому разрывы ковалентных связей распределяются по нитям случайным образом. В присутствии ионов марганца фермент расщепляет обе нити ДНК приблизительно в одном сайте, что приводит к образованию фрагментов ДНК, у которых концы нитей ровные или выступающие на один два нуклеотида. [c.185]

Представителями ДНКаз I являются панкреатические ДНКазы (М М000). Первичная структура панкреатической ДНКазы быка расшифрована она представлена одной нолипентидной цепью из 257 аминокислотных остатков. Оптимум pH лежит между 6,8 и 8,0. Фермент активируется ионами и и ингибируется анионами, связывающими указанные катионы, [c.225]

Интересен вариант мутагенеза молекул ДНК за счет встройки в случайные места экзогенных сегментов ДНК — природных фрагментов или синтетических линкеров (см. рис. 6.1, в). Случайные двухцепочечные разрывы можно вводить в молекулы ДНК путем кратковременного воздействия на них небольшого количества панкреатической ДНКазы I в присутствии катионов Мп2+. Получить молекулы ДНК с одиночными разрывами в разных местах можно, обрабатывая их рестриктазой, имеющей много участков узнавания на данном субстрате, так чтобы каждая молекула ДНК гидролизовалась в среднем лишь по одному участку. Таким образом, в частности, был получен первый гибридный фаг М13тр1 (см. 2.2.6). [c.173]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология