Ферменты лигазы

ДНК-лигазы — ферменты, катализирующие репарацию одноцепочечного разрыва, который обычно возникает под влиянием эндонуклеаз. Поэтому ДНК-лигазы называют еще исшивающими ферментами. Лигазы обнаружены в самых различных клетках, в том числе и в клетках, зараженных вирусами. Под влиянием этих ферментов образуются фосфодиэфирные связи между свободным 5 -фосфатным концом олнго- или полинуклеотида и З -гидроксильной группой соседнего олиго- или полинуклеотида. Скорее всего реакция протекает с обязательным образованием промежуточного комплекса лигазы с АМФ. Например, в клетках кишечной палочки такой комплекс образуется при взаимодействии лигазы с НАД, а в клетках млекопитающих такой комплекс образуется при взаимодейЛвии лигазы с АТФ. Предположительно схему действия ДНК-лигаз можно показать так (рис. 13) Катализируемые ДНК-лигазой ре- [c.51]

С помощью ферментативных методов можно эффективно осуществить два типа реакций конденсации, присоединение мономерного остатка к 5 -концу олигонуклеотида и соединение по типу голова-к-хвосту двух цепей с помощью фермента лигазы. Действие ДНК-зависимой РНК-полимеразы описано в разд. 22.5.2. [c.187]

В пробелах между нуклеотидами отсутствуют фосфодиэфирные связи, которые могут быть воссозданы с помощью ферментов лигаз, катализирующих реакции синтеза за счет 3 -гидроксильной и 5 -фосфатной групп [c.193]

Теперь добавим к каждому из образцов ДНК, отличающихся величиной т, фермент лигазу, зашивающий разрыв. Фермент может сделать свое дело, только если разорванные края подходят друг к другу стык в стык . Что же, он зашьет только те молекулы, для которых Л /уо = й Нет, не только. Дело в том, что молекула ДНК — это все-таки микроскопический объект. Одна из принципиальных особенностей микрообъектов, отличающая их от макрообъектов, к которым мы привыкли в повседневной жизни, состоит в том, что микрообъекты испытывают значительные изменения своей формы и размеров вследствие просто теплового движения. В нашем макромасштабе эти изменения не заметны, мы их просто не видим. [c.131]

Поэтому, когда мы добавим фермент лигазу к образцу, состоящему из строго одинаковых молекул ДНК, содержащих однонитевой разрыв, и потом проанализируем результат на гель-электрофорезе по методу Келлера, то обнаружим, что получился набор молекул, отличающихся друг от друга величиной Ьк. Ведь как только произошло залечивание однонитевого разрыва, молекула стала замкнутой кольцевой, и для нее вступает в силу теорема Уайта, согласно которой Ьк = Тш) [c.132]

К первой группе относится фиксирование двуокиси углерода за счет энергии АТФ (ферменты — лигазы) [c.285]

Полученный целевой ген с помощью ферментов лигаз сшивают с другим геном, который используется в качестве вектора для встраивания гибридного гена в клетку. В качестве вектора могут служить плазмиды, бактериофаги, вирусы человека, животных и растений. [c.99]

Обратное направление реакции — несамопроизвольный процесс для того чтобы происходил синтез глутамина, нужен внешний источник энергии, а также механизм использования этой энергии кроме того, чтобы реакция протекала достаточно быстро, нужен катализатор. Источником энергии в таких реакциях служит АТФ, а две другие функции выполняют ферменты лигазы (синтетазы). [c.68]

Последняя стадия этого процесса заключается в отжиге плазмиды и гена инсулина с образованием кругового дуплекса, который имеет четыре однонитевых разрыва. Последние защиваются ферментом лигазой, что приводит к образованию замкнутой кольцевой ДНК плазмиды. Она амплифицируется клонированием, давая достаточное количество копий для анализа последовательности ДНК. Проведенный анализ показал, что произошло включение 353 нуклеотидов гена препроинсулина. [c.214]

Лигазы (синтетазы). Они катализируют процессы конденсации двух молекул за счет энергии АТФ. Названия их включают оба соединяющихся вещества и фермент лигазу. Например, аспартат—аммиак—лигаза. [c.67]

После выделения рестриказ из разных форм бактерий исследователи получили возможность разрезать ДНК на какие угодно куски (каждая рестриказа гидролизует свои связи в молекуле ДНК), а затем с помощью других ферментов — лигаз сшивать куски в каком угодно порядке, и все это в пробирке . Конечно, это еще не было решением проблемы — так можно было создать только химерную молекулу ДНК, но ведь нужно было, чтобы она была биологически активной, могла размножаться в живой клетке да еще и менять ее генетические свойства. [c.562]

Химический и ферментативный синтез генов. Химический синтез гена впервые осуществил в 1970 г. Гобинд Хорана (США). В лаборатории этого ученого удалось химическим путем связать 77 дезоксирибонуклеотидов в цепочку ДНК, комплементарную к аланиновой транспортной РНК (г-РНК) пекарских дрожжей. Отрезки цепочки соединялись встык с помощью фермента лигазы. Две синтезированные нити соединялись химическими связями в спирализованную двутяжевую структуру. Такой искусственно созданный биополимер и стал геном аланиновой г-РНК, содержащейся в геноме дрожжей. Этот эксперимент — выдающееся достижение биоорганической химии. [c.166]

Генная инженерия возникла как результат всего развития науки о ДНК. Но событием, позволившим непосредственно приступить к перетасовке генов, было открытие ( зерментов рестриктаз. Рестриктазы узнают определенные, короткие последовательности нуклеотидов и разрезают молекулу ДНК в этом месте. Такие последовательности могут случайно встретиться в любой ДНК- Поэтому если подействовать какой-то рестриктазой на ДНК, скажем, мухи, а одновременно ею же на ДНК слона, то произойдет случайная перетасовка генов мухи и слона. Чтобы получились длинные гибридные, химерные или, как их еш,е называют, рекомбинантные молекулы, нужно лишь добавить фермент лигазу, сшиваюш,ий фрагменты ДНК друг с другом. Так в пробирке можно создать какие угодно комбинации генов, причем все они заведомо никогда не реализовались в живой природе из-за запрета на межвидовое скрещивание. [c.59]

Сейчас показано, что активацию каждой аминокислоты производит отдельный фермент — лигаза (К. Ф., 6.1.1). Активированные по карбоксилу аминокислоты можно выделить в виде а-ами-ногидроксамовых кислот, использовав высокие концентрации гидроксиламина. [c.267]

ДНК, комплементарного к цепи 50 первых нуклеотидов т-РНК аланина иллюстрируется на рис. 128. Синтезируются четыре цепи нуклеотидов изображенные в верхней части рисунка горизонтальными линиями. Каж дая из четырех цепей содержит по 20 нуклеотидов. Цепи построены так что верхняя правая линия соответствует 20 нуклеотидам ДНК, компле ментарньш к первым 20 нуклеотидам т-РНК аланина, верхняя левая линия соответствует двадцати следующим. Две нижние горизонтальные линии верхней части рисунка символизируют также отрезки ДНК по 20 нуклеотидов каждый, из них 20 - - 10 нуклеотидов комплементарны к соответствующим 30 нуклеотидам двух верхних цепей. В целом получается жестко связанная 30 парами комплементарных нуклеотидов система четырех цепей ДНК со свободными концами по 10 нуклеотидов в верхней и в нижней цепи. Имеются два разрыва фосфатных связей, отмеченные стрелками. Действием фермента лигазы эти разрывы зашиваются , и на их месте возникают фосфатные мосты. Таким образом, четыре первоначально взятых полинуклеотида превращаются в две цепи, в средней части комплементарно связанные друг с другом. Осталось с помощью полимеразы и набора свободных нуклеотидов комплементарно достроить оба свободных конца молекулы, и двойная спираль из 50 полинуклеотидов готова. Одна из ее цепей комплементарна к 50 первым нуклеотидам т-РНК, другая — комплементарна к первой. [c.695]

Для идентификации бактерий иногда используют также метод ДНК-зондов (генных зондов), являющийся разновидностью метода молекулярной гибридизации ДНК—ДНК. Реакция гибридизации ведется в этом случае не между двумя препаратами тотальной ДНК, а между фрагментом нуклеотидной последовательности ДНК (зондом), включающим ген (генетический маркер), ответственный за какую-то определенную функцию (например, устойчивость к какому-нибудь антибиотику), и ДНК изучаемой бактерии. Самым распространенным способом создания генных зондов является выделение специфических фрагментов путем молекулярного клонирования. Для этого вначале создают банк генов изучаемой бактерии расщеплением ее ДНК эндонуклеазами рестрикции, а затем отбирают нужный клон из суммы фрагментов ДНК методом электрофореза с последующей проверкой генетических свойств этих фрагментов методом трансформации. Далее выбранный фрагмент ДНК с помощью фермента лигазы вводят в состав подходящей плазмиды (вектора), а эту комбинированную-плазмиду вводят в удобный для работы штамм бактерий (например, Es heri hia соН). Из биомассы бактерии, несущей ДНК-зонд, выделяют плазмидную ДНК и метят ее, например, радиоизотопной меткой. Затем осуществляют гибридизацию ДНК зонда с ДНК бактерии. Образовавшиеся гибридные участки проявляют методом ауторадиографии. По относительной частоте гибридизации генетического маркера с хромосомой той или иной бактерии делают заключение о генетическом родстве этих бактерий с исследуемым штаммом. [c.197]

Пока еще слишком рано применять эти новые концепции к проблеме регуляции экспрессии генов у эукариот, но ясно, что должен существовать очень точный механизм ферментативного вырезанргя участков гяРНК такой механизм должен участвовать и в процессинге рибосомиой РНК. мРНК образуется из оставшихся фрагментов с помощью ферментов лигаз. [c.457]

Для получения рекомбинантной ДНК плазмиды выделяют из Е. соИ и удаляют из них часть кольцевой молекулы ДНК (рис. 5.13). Для этого применяют рестриктазы. Комплементарные цепи молекулы ДНК разрезаются в разных местах, в результате чего образуются липкие концы — неспаренные участки цепей, способные присоединять комплементарные им полинуклеотиды. На фрагменте ДНК, выбранном для пересадки, тоже создают липкие концы, используя ту же рест-риктазу, и, следовательно, на фрагменте ДНК образуются липкие концы, комплементарные липким концам рестриктированной плазмиды. Если теперь смешать фрагмент ДНК (ген) и плазмиду, то они соединятся липкими концами (см. рис. 5.13). Затем с помощью фермента лигазы образуют фосфодиэфирнук) связь между концевыми нуклеотидами обеих молекул, и вновь получают кольцевую молекулу ДНК, но теперь она вместе с плазмидной ДНК содержит ген, выбранный для пересадки. Это и есть рекомбинантная ДНК, т. е. ДНК, содержащая новую комбинацию последовательностей (или генов), такую, какой прежде в природе не было. [c.173]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология