Образование гетеродуплексов

ДНК/ДНК-гибридизация гомологичные последовательности нуклеотидов в ДНК разных видов. Как мы уже говорили, при нагревании изолированной ДНК две полинуклеотидные цепи расходятся в результате разрыва водородных связей. Такая денатурация (или плавление ), приводящая к образованию одиночных цепей, обратима при очень медленном охлаждении препарата будет происходить спаривание и реассоциация комплементарных участков. Если смешать короткие фрагменты денатурированных ДНК, полученных из двух различных, но близких между собой видов бактерий, при температуре выше точки их плавления и затем медленно охладить смесь, тоже будет происходить реассоциация. Двойные спирали, образовавшиеся из одиночных цепей ДНК двух разных организмов, называют гетеродуплексными молекулами. Для того чтобы в эксперименте можно было проследить за образованием гетеродуплексов, нужно, конечно, пометить ДНК одной из бактерий тяжелым или радиоактивным изотопом. [c.41]

Рис. 15.13. Выявление транспозонов путем электронно-микроскопического исследования гетеродуплексов. Для того чтобы сделать транспозон видимым, нагревают ДНК из бактерии дикого типа (В) и бактерия, несущей транспозон (А), и в результате цепи двойных спиралей расходятся ( плавление ). При последующем медленном охлаждении смеси происходит спаривание комплементарных оснований отдельных цепей ДНК А и В, что ведет к образованию гетеродуплексов ДНК. Если на концах транспозона имеются противоположно ориентированные комплементарные IS-элементы, то эти области тоже спариваются и образуют стебелек, на котором средняя часть транспозона выступает вбок в виде петли из одиночной цепи.

Присутствие более одной копии гена на хромосоме дает возможность проследить за этими событиями. Например, если образование гетеродуплекса и генная конверсия происходят и при этом захватывается часть гена, эта часть может иметь последовательность, идентичную или родственную другому гену, в то время как остающаяся часть проявляет большую дивергенцию. Установлено, что генная конверсия может захватывать до нескольких тысяч оснований. [c.453]

Если комплементарные цепи нативной двухцепочечной ДНК разделить посредством нагревания или в щелочной среде, то при правильно выбранной температуре и концентрациях солей в растворе, они довольно легко снова образуют двойную спираль. Мы уже встречались с несколькими примерами такой реассоциации при обсуждении образования гетеродуплекса ДНК в главах 7 и 8. [c.261]

РИС.3.9. Схематическое изображение плавления ДНК и образования гетеродуплекса при ренатурации. Показана только одна из двух эквивалентных пар гетеродуплексов, которые могут образовываться в каждой из рассмотренных смесей ДНК. [c.165]

ВИИ бромистого этидия и последующей обработки продукта экзонуклеазой III (Л) или с помощью образования гетеродуплекса между интактной вставкой и вставкой с делецией, клонированными в М13 (Б). [c.346]

Если, например, вырастить культуру одной из бактерий на тяжелой воде (D2O), то у нее будет тяжелая ДНК, и тогда образование гетеродуплекса можно будет выявить путем центрифугирования в градиенте плотности s l-так же, как в опыте Меселсона и Сталя было доказано образование N/ N-rH6pHfl-ной ДНК. Можно, однако, пометить ДНК одного из партнеров, выращивая его на среде с С или с Если теперь смешать длинные отрезки денатурированной ДНК (из непомеченной С бактерии А) с короткими отрезками денатурированной ДНК (из помеченной С бактерии В), медленно охладить смесь и провести ее через фильтр, задерживающий длинные цепи, но пропускающий короткие, то на фильтре останутся молекулы гетеродуплекса. Оставшаяся на фильтре радиоактивность будет тем выше, чем больше радиоактивных отрезков (В) связалось с А-депями, т.е. она будет зависеть от того, идентичны ли (либо очень сходны) последовательности оснований ДНК А и В или же они совсем различны. Таким образом, реассоциация ДНК/ДНК дает возможность определять степень гомологии последовательностей ДНК разного происхождения. Контрольный опыт проводят с молекулами ДНК из одних и тех же бактерий (одну пробу метят, другую не метят) и произвольно принимают степень реассоциации за 100. Степень реассоциации молекул ДНК из различных штаммов выражают затем в процентах от этой величины. Рутинные методы определения гомологии между ДНК различных штаммов бактерий многократно видоизменялись, но все они основаны на том же принципе образования гетеродуплексов во всех случаях необходимо пометить одного из партнеров. [c.41]

Гомологичность ДНК, т.е. совпадение последовательности оснований в молекулах ДНК двух разных штаммов бактерий, тем больше, чем ближе родство этих штаммов между собой. Этот способ оправдал себя при сравнении близких штаммов и видов между родами же, находящимися между собой в отдаленном родстве, степень гомологии ДНК слишком мала, чтобы можно было выявить образование гетеродуплексов. Одноцепочечная ДНК может реассоциировать и с РНК. Поэтому описанные методы позволяют также оценивать гомологию между ДНК и РНК. [c.41]

Белок Re A стимулирует спаривание оснований между отдельной цепью ДНК и комплементарной ей цепью в суперспиральной кольцевой молекуле. Одна цепь атакует кольцо, вытесняет исходную и спаривается с комплементарной цепью, в результате чего образуется D-петля. (рис. 35.7, верхний ряд). Эта реакция получила название поглощения или ассимиляции одной цепи. Процесс ассимиляции одной цепи родствен образованию гетеродуплекса, модель которого представлена на рис. 35.2. Разница состоит в том, что рекомбинационная модель предполагает два вторжения. В каждом случае одна цепь реципрокно вытесняет своего гомолога в двухцепочечной молекуле-партнере. [c.449]

Рис. 7.11. Схема образования гетеродуплекса между одноцепочечными молекулами ДНК, исходно входившими в состав двухцецо-чечных молекул, различающихся между со-

Контроль вариации фаз зависит от состояния промотора, направляющего транскрипцию генов Н2 и гН1. Это было показано с помощью клонирования соответствующей регуляторной области на плаз-мидном векторе с использованием методов, описанных в гл. 9. При выращивании клеток Е.соИ, содержащих плазмиду со встроенной регуляторной областью, можно получить огромную популяцию идентичных молекул. Плазмидную ДНК очищают и линеаризуют с помощью рестриктазы со RI (рис. 15.24). Денатурация и отжиг цепей ДНК приводит к образованию гетеродуплексов, содержащих цепи из различных исходных плазмидных молекул. Некоторые из этих гетеродуплексных молекул содержат негибридизующийся участок протяженностью около 800 п.н. (рис. 15.24). Появление этого участка, как оказалось, вызвано тем, что в некоторых плазмидах произошла переориентация участка протяженностью 800 п. н. Это наблюдение позволило предложить модель механизма вариации фаз, согласно которой промотор генов Н2 и гН1 может находиться в одной из двух ориентаций ( флип или флоп ). В одной из них транскрипция с этого промотора приводит к образованию белков Н2 и гН1, При другой ориентации транскрипции этих генов не происходит (рис. 15.25). [c.201]

Рис. 15.5. Образование гетеродуплекса между К-плаз-мидой К6К и ее делецион-ным мутантом К5Р1040 [7]. Гетеродуплексные молекулы ДНК получали из ДНК Двух плазмид, подвергавшихся одноцепочечному разрыву под действием рентгеновских лучей по методике, описанной в разд. 15.3.5. Петля слева представляет собой одноцепочечную (хх) ДНК плазмиды Н6К, которая отсутствует из-за делеции в плазмиде КЗР 1040. Большая петля справа — двухцепочечная ДНК ( 5), по которой можно рассчитать область гомологии обеих плазмид. В данном случае двухцепочечная область составляет около 70% ДНК плазмиды НбК.

Рнс. 7.7. Радиоавтографы хромосом человека (мужчины) (А) и шимпанзе (Б), демонстрирующие локализацию AT III РНК человека. У человека места скопления метки обнаруживаются главным образом в прицентромерном гетерохроматине хромосомы 9 стрелка) и Y-хромосоме стрелках небольшие скопления метки имеются и на некоторых других участках хромосом У шимпанзе большие количества AT А, сходство которой с AT III человека достаточно для образования гетеродуплексов, содержат около пяти пар хромосом [1938] [c.16]

Особого внимания в схеме Р. Холлидэя заслуживает способ образования гетеродуплексов. На рис. 7.12 показаны последовательные стадии образования полухиазмы А—В), которая затем может видоизменяться путем миграции вдоль конъюгирующих хроматид (молекул ДНК) на стадиях В, Г. Этот процесс получил название миграции ветвей полухиазмы. Зона переброски движется подобно застежке молния , удлиняя участки гетеродуплексов. При этом молекулы ДНК должны вращаться вокруг своих осей навстречу друг другу. Эксперименты с объемными молекулярными моделями показывают, что это возможно. Результаты тетрадного анализа у дрожжей, гетерозиготных по двум маркерам, между которыми известно расстояние, выраженное в числе пар нуклеотидов, показывают, что зона гибридной ДНК может распространяться на участки длиной около 1000 п. н. Об этом судят по способности к коконверсии мутаций, расположенных на таком расстоянии друг от друга. [c.164]

Сайт-специфический мутагенез с применением синтетических олигодезоксинуклеотидов. Олиго-дезоксинуклеотиды можно синтезировать в больщих количествах, что позволяет разработать достаточно универсальные методы получения сайт-специ-фических точечных мутаций в клонированных сегментах ДНК. В основе одного из таких методов лежит образование гетеродуплекса между одноцепочечным синтетическим олигодезоксирибонукле-отидом, содержащим мутантную последовательность, и комплементарной одноцепочечной рекомбинантной векторной ДНК, несущей соответствующий сегмент дикого типа (рис. 7.36). Для этого ген, в котором мы хотим получить мутацию, клонируют, например, в фаге М13 и получают одноцепочечную кольцевую рекомбинантную вирусную ДНК. Затем с этой кольцевой молекулой отжигают [c.347]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология