Изучение нативных белков

Авторам работы [630] удалось растворить мембранные ферменты в водно-органических растворах при низких температурах, избежав общепринятого метода солюбилизации с помощью детергентов путем образования мицелл в водных растворах. Они удалили липидные компоненты при —75 °С, при этом белок остался в нативном состоянии и сохранил активность. Таким образом, при низких температурах в растворителях, подобных смеси хлороформ—метанол, ферментативная активность не теряется, что открывает большие возможности в изучении мембранных белков. [c.238]

Как уже отмечалось выше, при облучении белков в сухом состоянии (стр. 251) часть радиационного повреждения, состоящая в деструкции белковой цепи, не обязательно проявляется сразу же вследствие упорядоченной структуры молекулы. Однако при нагревании поврежденный белок коагулирует намного легче, чем нативный белок [F8], Поврежденный белок также более чувствителен к денатурации мочевиной [М28]. При дальнейшем изучении физической химии процесса тепловой коагуляции оказалось, что после облучения белок существует в различных состояниях денатурации [F36, F37]. Возможно вследствие этих обстоятельств, действие излучения зависит от физического состояния белка. Например, предварительная обработка азотным аналогом иприта увеличивает действие излучения [К41], [c.258]

С другой стороны, каучук, вулканизированный серой, сохраняет свойства статистического клубка, несмотря на наличие ди- и полисуль-фидных мостиков. Изучение обратимой денатурации белков с разрывом и последующим спонтанным восстановлением первоначальных дисульфидных связей, прежде всего исследование К. Анфинсена [7] денатурации и ренатурации рибонуклеазы А, склоняет к предположению, что не 8-8-мостики создают нативную структуру, а, напротив, структура, формирующаяся за счет слабых взаимодействий, приводит к сближению вполне определенные остатки цистеина и тем самым обусловливает избирательное образование системы дисульфидных связей. Таким образом, можно заключить, что белковую глобулу создают слабые невалентные взаимодействия. Невалентные взаимодействия в водорастворимом белке мог) т возникать между пептидными группами основной цепи, между боковыми цепями аминокислотных остатков, между звеньями основной цепи и боковыми цепями. Кроме того, поскольку белок сохраняет свою нативную конформацию и функционирует только в водном растворе при определенных, так называемых физиологических значениях pH и ионной силы, то структура определяется также взаимодействиями белка с молекулами воды и находящимися в ней соединениями и ионами. Окружающая среда, помимо этого, оказывает конкурирующее и иное влияние на внутримолекулярные взаимодействия. Рассмотрим сложившееся мнение о природе перечисленных взаимодействий, об их вкладах в конформационную энергию и, следовательно, влиянии на стабильность пространственной структуры белковой молекулы. [c.232]

Выбранный для первого в научной практике априорного расчета белковой трехмерной структуры объект, безусловно, должен быть низкомолекулярным, однодоменным, состоять из одной полипептидной цепи и являться прямым продуктом биосинтеза. Далее, его нативная конформация должна включать систему дисульфидных связей, поскольку в настоящее время эти связи служат, если и не единственным, то, во всяком случае, самым надежным источником информации о структуре промежуточных метастабильных состояний. Кроме того, для выяснения принципов пространственной организации белков существенный интерес представляют количественные оценки основных факторов стабилизации двух сравнительно часто встречающихся регулярных форм пептидной цепи - а-спирали и -структуры. Поэтому желательно, чтобы пространственная структура выбранного для расчета белка содержала наряду с неупорядоченными участками также вторичные, регулярные структуры обоих видов. Понимание структурной организации белковых молекул не является конечной целью, а необходимо для последующего изучения их биологического действия, т.е. решения проблемы структурно-функциональной организации белков. Поэтому важно, чтобы белок, выбранный в качестве простейшего для изучения его структурной организации, оказался бы и удачным модельным объектом для установления принципов взаимосвязи между структурой и функцией. Он должен обладать простой и хорошо изученной экспериментально функцией. [c.427]

В работе [201 по экспериментальному изучению процесса де-натурации белков.показано, что на одной из начальных стадий денатурации молекула белка проходит через состояние "расплав-JRннoй глобулы", характеризующееся близостью к нативной форме по компактности и вторичной структуре. Авторы предположили, что белок проходит через такое состояние и при сворачивании. [c.142]

Так как при статистическом анализе невозможно учесть взаимодействия боковых цепей и определить их конформации, то и нельзя на основе эмпирического подхода прийти к пониманию принципов пространственной организации белковой молекулы. Ведь именно сложнейшая, строго упорядоченная, однако не сводящаяся к регулярной, система взаимодействий боковых цепей специфична для каждого природного аминокислотного порядка, а поэтому только она и ответственна за практически беспредельное многообразие трехмерных структур белковых молекул и их динамических конформационных свойств. Реализующееся пространственное строение белка определяется конкретной аминокислотной последовательностью. В силу уникальности последней ее нативная геометрия непредсказуема на основе среднестатистических характеристик уже изученных белков. Вероятностный подход адекватен синтетическим полипептидам, строение и свойства которых статистичны и описываются равновесной термодинамикой и статистической физикой. Белок же в физиологических условиях однозначно детерминирован как в отношении своих конформационных свойств, так и функции, и должен являться объектом рассмотрения нелинейной неравновесной термодинамики. [c.80]

Лучше изучен аминокислотный состав боковых цепей недеградированного белка. Потенциометрическим титрованием обнаружено присутствие 51 потенциально отрицательно заряженных групп (карбоксильные и фосфатные остатки) 5 групп, титрующихся в участке расположения имидазольной группы 22 остатка лизина и 14 гуанидиновых групп, что находится в хорошем соответствии с аналитическими данными [19]. Была исследована ионизация остатков тирозина измерением поглощения в ультрафиолетовой области при различных величинах pH. Тирозиновые остатки инсулина ионизируются при величине pH немного выше 10, в то время как тирозиновые остатки нативного яичного альбумина не ионизируются при pH 12. При pH около 12,5 происходят быстрые и необратимые изменения фенольные группы ионизируются и остаются в ионизированном состоянии даже тогда, когда pH повторно сдвигается в область ниже 12. При этом белок денатурируется. Более того, яичный альбумин, который денатурируют другими методами, содержит остатки тирозина в ионизированном состоянии при pH ниже 12 [20]. Причина этого явления, наблюдаемого как для альбумина, так и для некоторых других белков [21], пока не ясна. Водородные связи фенольных гидроксильных групп с другими группами внутри молекулы могут быть необходимы для поддержания четвертичной структуры нативного белка [22]. С другой стороны, непосредственное окружение фенольных групп внутри молекулы может быть сильно изменено денатурацией [20]. Некоторые из боковых групп нативного белка недоступны для действия химических реагентов. Как можно было ожидать, остатки тирозина легко реагируют с кетонами только после денатурирования белка [23]. Из общего числа е-аминогрупп альбумина, равного 20, только три группы реагируют с 1-фтор-2,4-динитробензолом в условиях, когда белок не денатурирован [24]. [c.10]

Механизм по схеме (22) расширен на схеме (23) [45]. Известно, что основание Шиффа (22) легко восстанавливается гид-ридными донорами. Подходящим агентом, который можно использовать в водном растворе, является борогидрид натрия. Поэтому можно было надеяться зафиксировать интермедиат (22), восстанавливая его в стабильный вторичный амин при проведении реакции в присутствии NaBH4. Эксперимент проводили с использованием С-меченного ацетоацетата, и фермент инактивировался, как и предполагалось для случая, если ЫНг-группа активного центра превращается во вторичный амин (ЫаВН4 не инактивирует фермент в отсутствие субстрата). Неактивный белок, выделенный из реакционной смеси, содержит, как и предполагалось, один эквивалент С на молекулу. Затем белок был подвергнут деградации обычными методами и изучен его аминокислотный состав (эти методы обсуждаются в части 23). Аминокислотный анализ показал в сравнении с нативным ферментом исчезновение одного остатка лизина и появление новой аминокислоты. Последняя была иден- [c.480]

Малость длины дебройлевской волны для электрона означает большой радиус сферы Эвальда (см. стр. 268), ее вырождение в плоскость. Это сильно упрощает истолкование электро-нограмм, так как они оказываются прямыми изображениями плоского сечения обратной решетки кристалла. Атомные факторы для рассеяния электронов также пропорциональны атомному номеру, но по своей абсолютной величине они во много раз больше, чем для рентгеновских лучей. Иными словами, электроны взаимодействуют с веществом значительно сильнее, чем рентгеновские кванты. Поэтому они сильно поглощаются веществом, и для исследования его структуры необходимо пользоваться очень тонкими пленками толщиной порядка 10 —10 см, тогда как размеры кристаллов, изучаемых в рентгенографии, порядка 10 см. Исследование необходимо проводить в высоком вакууме. Это делает невозможным применение электронографии для изучения глобулярных белков в их нативном состоянии — вакуум высушит белок. Тем не менее электронография позволяет получить ценные результаты при исследовании фибриллярных белковых структур, синтетических полимеров и других аморфных тел. Существенное преимущество электронографии состоит в том, что она позволяет локализовать атомы водорода (подробное изложение см. в монографиях [31, 32]). [c.275]

Поскольку в ковалентном остове полипептидной цепи все связи одинарные, можно было бы ожидать, что полипептид способен принимать в пространстве бесконечное число конформаций. Более того, естественно было бы предположить, что конформация полипептида претерпевает постоянные изменения вследствие теплового движения и беспорядочного вращения участков цепи вокруг каждой из одинарных связей ковалентного остова. Поэтому может показаться парадоксальным тот факт, что полипептидная цепь нативного белка в нормальных биологических условиях-при обьиной температуре и нейтральных значениях pH-имеет только одну или очень небольшое число конформаций. Эта нативная конформация достаточно устойчива если вьщеление белка вести осторожно, избегая воздействий, приводящих к развертыванию цепей и денатурации, то выделенный белок может полностью сохранить свою биологическую активность. Это свидетельствует о том, что вокруг одинарных связей полипептидного остова в нативных белках свободное вращение невозможно. И мы скоро убедимся, что это действительно так. Но сначала мы вкратце ознакомимся с биологией (сератмнов-фибриллярных белков, структура которых дала ключ к изучению конформации белков. [c.167]

С другой стороны, методы исследования структуры белков продолжали оставаться слишком грубыми. Химики еще не могли оперировать с нативными (нетронутыми) молекулами белков. Очень важным было то, что полученные и изученные продукты разложения не охватывали всей молекулы белка. Огромная часть молекулы бесследно терялась на различных промежуточных этапах разделения и очистки. Господствовало убеждение, что белки, которые подвергались анализам, это далеко не те белки, которые существуют в организме. Э. Абдергальден, ученик и последователь Э. Фишера, писал по этому поводу Следует считаться с тем, что поскольку тот или иной белок не находится в организме в твердом состоянии, всегда возможна некоторая денатурация во время выделения белков и очистки выделенного продукта. Поэтому приходится учитывать возможность ряда отличий белка, находящегося в организме, от изучас мого [57]. [c.93]

Менее гидрофобные мембранные белки можно солюбилизировать при низких концентрациях мягкого детергента. Это позволяет получить их если не в нативной, то по крайней мере в функционально активной форме. Если же детергент 5атем удалить в отсутствие фосфолипидов, го мембранные белки обычно агрегируют и выпадают в осадок (рис. 6-20). Однако если очищенные белки смешать с фосфолипидами до удаления детергента, то белки в активной форме обычно встроятся в липидный бислой, формируемый молекулами фосфолипидов (рис. 6-21). Таким образом можно реконструировать функционально активные системы мембранных белков из очищенных компопептов. Это один из возможных подходов к изучению их функциональной активности. Например, если удается показать, что очищенный белок перекачивает ионы через [c.362]

Возможность экспрессии клонированных эукариотических генов в клетках Е. соИ способствовала углубленному изучению множества белков, представляющих интерес для фундаментальных научных исследований и медицины. В тех случаях, когда нативный негибридный белок экспрессируется недостаточно эффективно, часто экспрессия белков или их фрагментов в виде гибридов с полипептидами Е.соИ, такими, как -галактозидаза, оказывалась более успешной. К тому же гибридные белки можно легко очищать с помощью хроматографических методов, разработанных для -галактозидазы. Эукариотические белки, экспрессируемые в составе гибридных продуктов, были с успехом использованы при изучении иммунологически важных участков поверхностных антигенов [1], функций рекомбинантных полипептидов [2], при получении иммунологических зондов, необходимых для исследования ранее не изученных антигенов [3—6], для экспрессии вариантных форм белковых субъединиц и для выделения и исследования клонов ДНК из экспрессирующихся библиотек генов [8—10]. Технология работы с экспрессирующими векторами достигла столь высокого уровня развития, что стало возможным осуществлять в клетках Е. соН достаточно эффективную экспрессию практически любой кодирующей последовательности с образованием гибридного продукта, который можно выделить с помощью разнообразных биохимических методов и использовать его либо в различных функциональных исследованиях либо в качестве иммуногена. Синтез чужеродного полипептида в виде гибридного белка с -галактозидазой, по всей вероятности, значительно увеличивает стабильность этого полипептида в клетках Е. соИ. По-видимому, стабильность белка, а не сила промотора — наиболее важный фактор для успешной экспрессии рекомбинантных белков в бактериях. [c.138]

Дальнейшая работа с мембранными белками - изучение их функций, механизмов действия и пространственных структур, однако, натолкнулась на большие трудности. Оказалось, что высвобождение белковых молекул из мембраны часто сопровождается необратимой денатурацией их нативных структур и, следовательно, потерей активности. В редких благоприятных случаях при солюбилизации белков в мягких условиях и при низких концентрациях функциональные свойства не пропадают, что указывает на сохранение, по крайней мере частичное, нативных конформаций. Наиболее детальная информация о белках и липидном бислое получена при изучении плазматической мембраны эритроцитов человека, содержащих гемоглобин -немембранный белок, представленный в этих клетках в наибольшем количестве [237]. Удобство данного объекта обусловлено тем, что мембраны эритроцитов, называемые "тенями", являются единственными в Клетке и их легко выделить в чистом виде с разрывом и без разрыва и даже получить вывернутыми наизнанку. При изучении теней эритроцитов впервые удалось установить, что некоторые мембранные белки пронизывают насквозь мембранный бислой, а внешняя и внутренняя стороны мембраны являются асимметричными [238]. Исследования белков плазматической мембраны эритроцитов человека [c.57]

Качественное изменение ситуации в изучении механизмов свертывания белковых цепей наметилось в самом конце 1980-х годов. Оно вызвано открытием нового класса белковых молекул, существование которых мало кто предполагал, во всяком случае, оно представлялось маловероятным. Их функции в жизнедеятельности клеток заключаются в содействии правильной невалентной сборки других белков, не становясь, однако, компонентами их окончательных физиологически активных структур. Белки этого класса получили название молекулярных шаперонов . Открытие шаперонов вместе с известными ранее, но необобщенными и не привлекшими к себе должного внимания данными поколебало, особенно на первых порах, общепринятую точку зрения на принципы структурной организации белковых молекул. Новые факты неизбежно вели к заключению, что существовавшее представление о свертывании полипептидной цепи in vivo как о самосборке белка, по меньшей мере не совсем точно отражает реальный процесс. Необходимость пересмотра устоявшегося мнения о взаимосвязи между химическим и пространственным строением белковых молекул диктовалась новыми экспериментальными данными, число которых начинает возрастать лавинообразно. Все они свидетельствовали об уменьшении выхода, замедлении скорости и даже полном прекращении сборки трехмерных структур одних белков по мере снижения вблизи рибосом концентрации других белков. Стали известны две группы молекулярных посредников, функции которых в клеточной сборке белковых цепей оказались значительными и разнообразными. Они влияют на скорость свертывания цепи, целенаправленно ускоряя или замедляя созревание нативной конформации, определяют порядок формообразования сложных комплексов, стимулируя реорганизацию белок-белковых взаимодействий в олигомерных структурах, облегчают деградацию неправильно свернутых цепей, стабилизируют, транспортируют и соединяют в соответствующих клеточных компартментах [c.412]

Обобш ая результаты вышеописанных исследований по изучению УФ-индуцированных изменений функциональной активности Na% К+-АТФазы и АХЭ эритроцитарных мембран, обработанных фосфолипазой D, можно заключить, что в присутствии последней проявляется различная фоточувствительность этих ферментов, обусловленная нарушениями их нативной конформации вследствие модификации белок-липидных взаимодействий, а также влияния фотохимических продуктов молекул мембранных фосфолипидов. [c.172]

В случае восстановления внутрицепьевых дисульфид-ных связей в молекуле рибонуклеазы в присутствии концентрированной мочевины такой белок утрачивает, по данным физических методов исследования, нативную конформацию. Одновременно происходит разрушение его антигенных детерминант, поскольку денатурированный белок не реагирует с антителами против нативного белка. Однако восстановление двух из четырех дисуль-фидных связей в молекуле рибонуклеазы, выполненное в отсутствие денатурирующих агентов, не сказывается на антигенных свойствах фермента. Аналогичные данные были получены при изучении пепсина, папаина, иммуноглобулина О. Следовательно, сама по себе дисульфидная связь не определяет структуры антигенных детерминант, если при ее разрыве не разрушают стабилизирующих вторичную и третичную структуру нековалентных связей. [c.31]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология