Протеазы с высокой специфичностью

Таблица 3.1. Протеазы с высокой специфичностью

ПРОТЕАЗЫ С высокой СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ 149 [c.149]

ПРОТЕАЗЫ С ВЫСОКОЙ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ 151 [c.151]

ПРОТЕАЗЫ С ВЫСОКОЙ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ 153 [c.153]

ПРОТЕАЗЫ С высокой СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ 155 [c.155]

Основное внимание в этой главе уделено методам получения крупных фрагментов белка и соответственно методам ограниченного гидролиза с использованием ферментов, обладающих высокой специфичностью. Использование таких методов играет существенную роль как в определении аминокислотной последовательности белков, так и в структурно-функциональных исследованиях. Наиболее специфические протеазы гидролизуют полипептидную цепь по основным аминокислотным остаткам — Lys и Arg или по кислотным — Glu. Другие ферменты обладают более широкой специфичностью к гидрофобным аминокислотным остаткам. Тем не менее такие ферменты нашли широкое применение при дополнительном гидролизе крупных фрагментов белка. В этой главе описаны также свойства протеазы, гидролизующей по остаткам пролина. Этот фермент представляет несомненный интерес, но в настоящее время еще не получил широкого применения. Следует надеяться, что возможности аналитической химии белка будут расширяться в дальнейшем благодаря выпуску новых коммерческих препаратов из числа описанных в этой главе и открытию новых высокоспецифичных ферментов. [c.160]

Реакции конденсации, катализируемые протеазами, обладают по сравнению с химическими методами следующими преимуществами полное исключение рацемизации, простота проведения процесса, минимальные требования к защите функций боковых цепей и др. Недостатком является, однако, невозможность универсального применения протеаз из-за их высокой специфичности. Кроме того, иногда бывает трудно предсказать ход реакции. После дальнейших методических усовершествований ферментативная каталитическая конденсация может стать еще одним полезным методом в пептидной синтетической химии. [c.169]

Схема разделения и очистки пептидов, описываемая ниже (включающая гельфильтрацию, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе или дауэксе-50, высоковольтный электрофорез и хроматографию на бумаге), применима к белкам средней молекуляр-1ЮЙ массы (до 40 000). Крупные фрагмеггты, плохо разделяющиеся на бумаге и элюирующиеся с нее, первоначально отделяют гель-фильтрацией, а основную часть пептидов после фракцио- шрования на ионообменнике очищают окончательно хроматографией на бумаге. Однако эта схема применима далеко ие ко всем типам гидролизатов белков. Например, мембран11ые белки плохо расщепляются ферментами с высокой специфичностью, такими, как трипсин или стафилококковая протеаза гидрофобные пептиды склонны к образованию агрегатов при гель-фильтрации, осаждаются на ионообменных колонках и экстрагируются в охлаждающую среду при высоковольтном электрофорезе на бумаге и в органическую фазу при промывках в реакции Эдмана. Оптимальная схема анализа структуры мембранных белков включает их фрагментацию с помощью химических методов на небольшое число крупных пептидов, разделение в денатурирующих условиях на полиакриламидных гелях и определение аминокислотной последовательности автоматическим методом после присоединения пептида к твердой матрице. Альтернативный вариант основан на использовании протеаз с низкой специфичностью (таких, как пепсин или эластаза). При этом образуется значительное число коротких пептидов, которые [c.352]

Одним из наиболее исследованных семейств ферментов являются сери-нопротеазы. Все они предназначены для расщепления полипептидньгх цепей белков по механизму, в котором участвует боковая цепь аминокислоты серина (— Hj—ОН), находящейся в активном центре фермента. Три такие протеазы (трипсин, эластаза и химотрипсин) синтезируются в поджелудочной железе и вьщеляются ею в кишечник, где они превращают содержащиеся в пище белки в аминокислоты, способные всасываться через стенки кишечника. Благодаря возможности легко изолировать эти ферменты и их сравнительно высокой устойчивости их удалось интенсивно исследовать химическими способами еще до того, как стало возможным проведение рентгеноструктурного анализа белков. В настоящее время биохимический и рентгеноструктурный анализы позволили установить достаточно ясную картину функции этих ферментов, иллюстрирующую два аспекта действия любых ферментов каталитический механизм и специфичность к субстрату. [c.318]

Протеазы. Яды гремучих змей и гадюк в отличие от элапид и морских змей характеризуются высоким содержанием термолабильных кислых протеаз (Jimenez-Porras, 1970). Протеазы змеиных ядов активно расщепляют как природные (казеин, гемоглобин, желатин), так и синтетические (ТАМЕ и ВАЕЕ) белковые субстраты (Д. Н. Сахибов с соавт., 1972). Следует отметить, что использование синтетических субстратов позволило Tu et al. (1965, 1966) показать, что яды гадюковых и гремучих змей гидролизовали специфичные для трипсина субстраты (ТАМЕ и ВАЕЕ), но на последний действовали активнее трипсина. Почти все указанные яды не действовали на субстраты, специфичные для химотрипсина. [c.86]

Изменение активности ферментов. Микроорганизмы, окисляющие спирты, отличались высокой активностью внеклеточных ферментов, особенно протеолитических. Микробные протеазы являются, как правило, внеклеточными ферментами и, как видно из данных табл. 5.4 и 6.5, обладают широкой видовой специфичностью. Внеклеточные и внутриклеточные протеазы микроорганизмов, окисляющих алканы, нафтены и арены, отличались различной активностью. У большинства исследованных нами видов и физиологических групп бактерий (см. табл. 4.5 и 5.4) протеазная активность в клетках выше, чем в культуральной жидкости. С другой стороны, активность клеточных протеаз более стабильна, чем в культуральной жидкости, и меньше подвержена влиянию внешних воздействий, включая и действие высоких концентраций солей. В отличие от этого протеазная активность культуральной жидкости микроорганизмов, окисляющих спирты, превышала активность клеточных ферментов (табл. 6.5). [c.177]

В отличие от сериновых протеаз, у которых главным специфическим центром связывания служит подцентр 5ь у папаина специфичностью к гидрофобным аминокислотам обладает подцентр 82, а за специфичность к изолейцину или триптофану ответствен подцентр 51 [97]. Гидролиз эфиров, а возможно, и пептидов сопровождается образованием ацилфермента (как и в случае сериновых протеаз, за исключением того, что ацилируется Су8-25) [98—101]. График, построенный в координатах pH ксг11К1л , представляет собой колоколообразную кривую с максимумом при рН 6, что обусловлено ионизацией Н18-159 и Су8-25, р/Са которых равен 4,2 и 8,2 соответственно. Обозначим гистидин через 1т, а цистеин — через К5Н. При низком pH неактивна ионная форма К5Н.Н1т+, тогда как при высоком — форма К5-.1т. При нейтральном pH каталитически активная форма представляет собой один из таутомеров — КЗНЛт или К5 .Н1т+ исследование рН-зависимости не позволяет различить два ионных состояния, несущих одинаковый суммарный заряд ( принцип кинетической эквивалентности , гл. 2, разд. Е). рН-зависимость ксах для деацилировання определяется ионизацией основания с р/Са около 4. Возможно, этим основанием является группа, принадлежащая Н18-159, поскольку цистеин блокирован в ацилферменте. Механизм реакции можно представить с помощью следующей схемы [c.374]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология