Деформирующие буферы

Схема выглядела бы нелепо, так как буфер из трубки и верхнего резервуара должен был вылиться в нижний. Эту трудность можно обойти, если придать каналу с жидкостью U-образную форму. Такие приборы использовались на первых этапах развития метода (электрофорез в свободной жидкости). Хуже другое в жидкости нельзя избежать конвекции, которая деформирует и смешивает разделяющиеся зоны. Поэтому в современных приборах рабочий канал заполняют гелем, что на схеме изображено штриховкой. Достаточно чистая и хорошо смачиваемая (гидрофильная) пространственная сетка геля удерживает жидкость от вытекания и препятствует конвекции. Вместе с тем используемые гели содержат очень много жидкости (80—99,5%), в которой (т. е. в рабочем буфере) и мигрируют макромолекулы. Наличие сетки геля вносит важную дополнительную деталь в картину электрофоретической миграции. Теперь фракционируемые макромолекулы любых размеров неизбежно сталкиваются с нитями полимера, образующего сетку геля, что увеличивает эффективное трение о среду, а следовательно, снижает скорость движения молекул. Очевидно, что препятствия для миграции становятся особенно серьезными, если средний диаметр пространственных ячеек геля оказывается соизмерим с размерами макромолекул. В этом случае решающее влияние на электрофоретическую подвижность различных макромолекул и степень разделения оказывает соотношение их линейных размеров. Возможна даже такая ситуация, когда особенно крупные молекулы белков или нуклеиновых кислот вообще не смогут протиснуться через поры геля и их миграция прекратится. [c.4]

Вторая трудность связана с необходимостью создания удобной и надежной камеры элюции для сбора белков по мере их последовательного выхода из геля. В многочисленных конструкциях, предлагавшихся в начале 70-х годов, такую камеру создавали под вертикально расположенным гелем, отделяя ее от нижнего электродного буфера диализной пленкой. Для сохранения качества разделения белков камера элюции очень малого объема должна быстро и полно, без застойных зон, промываться элюирующим буфером, а выходящие из геля белки не должны сорбироваться на ее поверхностях, в частности на диализной пленке. Удачного решения этих проблем найдено не было. Столб геля, деформируясь под собственной тяжестью, сползал в камеру, застойные зоны при элюции приводили к смешиванию белков из разных полос, сорбция на пленке оставалась значительной. [c.116]

Заключительная стадия — элюция с колонки — часто оказывается камнем преткновения для всего процесса. Взаимодействия между антигеном и антителом характеризуются константами диссоциации порядка 10 —10 М. Подставив эти значения как величины Кр в уравнение (4.5), мы получим значение а, близкое к единице. Ослабить специфические взаимодействия не просто. Хотя иммуноглобулины — весьма прочные молекулы и могут выдержать достаточно жесткие условия, необходимые, чтобы разрушить специфические взаимодействия, это не обязательно справедливо в отношении вытесняемого фермента. Так, при pH 2—3 антиген будет вытеснен, а оставшиеся на колонке антитела сохранят свою активность, так что колонку можно будет снова использовать однако весьма вероятно, что при pH 3 фермент будет разрушен. Сходные последствия обычно наблюдаются при использовании высоких концентраций мочевины и органических растворителей с целью соответственно уменьшить число водородных связей и ослабить гидрофобные взаимодействия. Применение высоких концентраций солей может быть успешным, если наблюдаются преимущественно электростатические взаимодействия, но в этих условиях усиливаются гидрофобные связи. Хаотропные соли, такие, как тиоцианат или иодид, бромид лития, хлористый магний и так называемые деформирующие буферы, например имидазолцитрат, дают довольно хорошие результаты, но опять-таки необходимые концентрации этих веществ могут вызывать денатурацию десорбированного фермента. Была описана методика быстрой элюции денатури-)ующим агентом, позволяющая получить активный антиген 102]. Эта методика заключается в том, что адсорбент помещают в верхнюю часть обессоливающей колонки, и поэтому, как только фермент покидает слой адсорбента, он сразу же отделяется от элюирующего агента (рис. 4.49). При малых количествах белка контакт с элюирующим агентом не превышает 1 мин, и за это время может произойти лишь незначительная денатурация белка. [c.175]

Ряд алкилагароз со структурой СНз(СН2)пМН—сефароза (где п принимает значения от О до 7), и-аминоалкилагароз со структурой ЫН2(СН2)п ЫН—сефароза (где п — от 2 до 8) характеризуется близким содержанием алкильных боковых цепей на гранулу геля [15, 49]. В одинаковых условиях (pH, ионная сила, состав буферного раствора и температура) способность СНз(СН2)пЫН—сефарозы удерживать фосфорилазу Ь зависит от длины углеводородных цепей. При хроматографии на производных сефарозы (я = 0 или 1) фосфорилаза Ь выходила из колонки с фронтом растворителя при п = 2 происходила задержка фермента, а при п = 3 фермент адсорбировался. Элюирование фосфорилазы Ь с модифицированной сефарозы (п = 3) возможно с помощью деформирующих буферных растворов, которые, как было показано, приводят к обратимым структурным изменениям фермента. На производном сефарозы с л = 5 связывание фосфорилазы было настолько сильным, что фермент не элюировался с колонки, даже когда pH деформирующего буферного раствора понижался до 5,8, хотя деформирующая способность такого буфера намного выше. Освободить фосфорилазу Ь из комплекса с этим производным можно только в неактивной форме после промывки колонки 0,2 М уксусной кислотой. Сама агароза содержит отрицательные заряды, а связывание алкил- или ариламинов на активированной бромцианом агарозе вводит в гель положительные заряды (разд. 8.2.4). В связи с этим йост и др. [28] обращали внимание на то, что на сефарозе с алкиламинами, прикрепленными после предварительной активации носителя бромцианом, связывание белков происходит большей частью при pH выше изоэлектрической точки выделяемых белков. Поэтому допускалось, что в этих случаях электростатические взаимодействия с положительно заряженной Ы-замещенной изомочевиной более существенны для связывания, чем гидрофобные взаимодействия с гидрофобной боковой цепью. Тем не менее гранулы агарозы не связывают фосфорилазу Ь, пока к ним не будут прикреплены алкильные боковые цепи некоторой минимальной длины. Кроме того, отмеченные выше заряды в равной мере присутствуют во всех членах гомологического ряда, и, следовательно, они не могут быть причиной различий в степени [c.152]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология