Культуры клеток микроносители

Эти системы обеспечивают истинные гомеостатические условия без изменений концентрации питательных веществ и метаболитов, а также числа клеток. Гомеостаз обусловлен постоянным вхождением среды в культуру и одновременным удалением равного объема среды с клетками. Поэтому такие системы пригодны только для суспензионных культур и монослойных культур на микроносителях. Подробнее о культурах с постоянным протоком будет сказано в разд. 4.6. [c.73]

II. Посев культуры. При посеве культуры с микроносителями критичными оказываются многие факторы, перечисленные в разд. 2. Микроносители имеют сферическую форму, а клетки всегда прикрепляются к участкам с минимальной кривизной. Хотя поверхность микроносителей не может быть идеальной, но она обязана быть приемлемой по своим химическим и физическим свойствам. Убедившись в том, что среда и гранулы находятся при оптимальных pH и температуре, вносите в культуру клетки (с логарифмической, но не со стационарной фазы культуры) в объеме среды, составляющем треть конечного объема. Это увеличивает вероятность контакта клетки с микроносителем. Конечная концентрация микроносителей должна составлять 2—3 г/л, а более высокие концентрации требуют повышенного контроля условий культивирования и очень частых смен среды. Раньше предпочитали проводить связывание [c.89]

HI. Поддержание культуры. Анализ роста клеток в культуре на микроносителях не представляет никакой проблемы. Легко производится отбор проб, определяется число клеток (по подсчету ядер), концентрация глюкозы и исследуется морфология клеток. По мере роста клеток гранулы микроносителя становятся тяжелее, что требует увеличения скорости вращения. После 3 дней культивирования или около того происходит за-кисление культуры и следует сменить среду. Это также оказывается чрезвычайно простой процедурой мешалка отключается, гранулам с клетками дают осесть в течение 5 мин и затем удаляется столько среды, сколько нужно. После этого культура осторожно заполняется свежей средой, нагретой до 37 °С, и перемешивание возобновляется. [c.90]

Из-за повышенной чувствительности животных клеток к различным внешним воздействиям важно исключить не только повреждающее действие перемешивающих систем в биореакторах, но и заметные колебания температуры, поскольку ниже 37°С клетки растут очень медленно, а выше 37°С они теряют жизнеспособность. Температурный контроль при этом осложняется тем, что скорость перемешивания среды с микроносителем малая и, следовательно, эффективность теплопередачи заметно снижается. Однако в отличие от микробных ферментаций, здесь нет проблемы с отводом тепла, образующегося в процессе метаболизма клеточной культуры. Определено, что теплоемкость должна быть 712 10 Дж/час/л культуры, содержащей 10 клеток. [c.348]

Глубинное выращивание клеток в суспензионных культурах. Площадь выращиваемых клеток можно существенно увеличить при использовании микроносителей, суспендируемых в питательной среде и на поверхности которых клетки закрепляются, а затем разрастаются в виде монослоя. Такие суспендированные микроносители с клетками моделируют глубинные культуры, например, микроорганизмов. Следовательно, в таких системах совмещаются монослойные и суспензионные культуры животных клеток. [c.540]

IV. Сбор клеток. Для многих типов клеток сбор их с микроносителей оказывается весьма трудной задачей, если клетки не достигнут высокой плотности на гранулах. К сожалению, нет оснований ожидать многослойного роста клеток на микроносителях это случается крайне редко. Сбор клеток начинается с удаления среды, по крайней мере одноразовой промывки гранул с клетками буфером и суспендирования микроносителей с клетками в растворе соответствующего фермента. Культура затем перемешивается при высокой скорости (75—125 об/мин) в течение 20—30 мин. Если клетки открепятся, то значительная их часть может быть собрана, если дать гранулам осесть в течение [c.90]

С ДИПЛОИДНЫМИ клетками человека, недостаточно хороши, что бы можно было рекомендовать такую процедуру для культивирования этих клеток. Успешное выращивание клеток человека достигается только на оборудовании лабораторного масштаба (менее 20 л), где процессу культивирования можно уделять гораздо больше внимания. Одной из проблем культур большого объема становится необходимость большого количества рассеиваемых клеток. Сбор клеток с больших блоков крупномасштабных культур не всегда проходит очень удачно, хотя использование коллагеновых и желатиновых микроносителей значительно упростило эту проблему. Стоимость микроносителей достигает 1200—1500 фунтов стерлингов за 1 кг. Иногда возможно промывание и повторное использование гранул микроносителей, но это, естественно, невозможно в случае желатиновых и обработанных коллагеназой гранул, [c.94]

VI. Общий анализ использования культур с микроносителями. Культуры с микроносителями используются в промышленности для получения вакцин и интерферона в ферментёрах объемом до 1000 л. Для этих процессов используются гетероплоидные или первичные клетки. К сожалению, результаты, полученные [c.93]

Магнитный стержень индуцирует только радиальные перемещения и не вызывает подъема жидкости и турбуленций. Ротор типа морского винта более эффективен в суспензионных культурах, чем ротор типа турбины с плоскими лопастями, применяемый во многих бактериальных системах, поскольку ротор типа винта обеспечивает лучшее перемешивание при низких скоростях вращения. Если клетки слишком хрупки или если достаточное перемешивание не может быть достигнуто при скоростях, не создающих еще повреждающих сил сдвига, следует прибегнуть к другим системам перемешивания с использованием пневматической энергии (перемешивание при пробулькивании воздуха, как, например, в ферментёрах с воздушным лифтом) или гидравлической энергии (перфузия средой). Использование этих методов позволяет увеличивать масштаб культивирования без повышения подводимой мощности. Для увеличения эффективности механического перемешивания можно изменить конструкцию лопастей мешалки (как, например, в случае культур с микроносителями) или использовать несколько роторов. Некоторые примеры приведены на рис. 3.8. [c.99]

Использование заключенных в полимерный матрикс клеток в ферментёрных культурах представляется заманчивой техникой получения клеточных продуктов. Во многих случаях в этом методе могут быть использованы преимущества культуры с микроносителями (гранулы с растущими на их поверхности клетками) в смене среды и в соотношении объемов клеток и среды. Кроме того, заключение клеток в матрикс может быть использовано для облегчения перфузии или смены среды, и продукты можно будет получать свободными от клеток. [c.107]

В противоположность суспензионным культурам клеток на микроносителях разработаны способы инкапсулирования их в полимерные сферы (полилизиновые, агарозные, из полимерных смол), когда клетки, по-существу, не испытывают того механического напряжения, которое они должны проявлять в свободном виде. Эти способы оказались выгодными для культивирования гибридом в целях получения моноклональных антител. Диаметр микрокапсул, размер пор в них и их толщина могут быть независимо проконтролированы в процессе изготовления и оптимизированы для конкретного типа гибридом. Например, согласно данным фирмы Damon Biote h (Германия) гибридомные клетки человека или животных вначале суспендируют в биосовместимом растворе [c.541]

Другими примерами использования интактных клеток с неизмененным геномом для производства лекарственных препаратов могут быть синтез интерферона культивируемыми клетками лимфобластомы (процесс Well ome Foundation, см. разд. 8.3.2) и вирусных антигенов для выработки вакцин при выращивании клеточных культур на инертных микроносителях. [c.328]

Микроносители представляют собой мелкие твердые частицы (поддерживаемые в суспензии благодаря перемешиванию), на которых клетки растут в форме монослоя. Использование микроносителей дает клеткам, обладающим адгезивными свойствами, все преимущества крупномасштабных суспензионных культур. Поверхность бус-микроносителей может иметь положительный заряд, а различные клетки характеризуются оптимальным ростом при несколько различных поверхностных зарядах. По уверению фирмы Flow Laboratories (приложение 3), выпускаемые ими супербусы обладают поверхностным зарядом, пригодным для максимального числа типов клеток. [c.40]

Система замкнутого перфузионного контура постоянно (или по сигналу) извлекает среду из культуры и пропускает ее через устройство для оксигенации, а затем возвращает в культуру. Этот метод обладает многими преимуществами, если легко отделять среду от клеток для пропускания через перфузионный контур. Среда в устройстве для оксигенации эффективно про-булькивается для насыщения кислородом и другими компонентами, такими, например, как ЫаОН для контроля pH, который может повреждать клетки, если его добавлять непосредственно в культуру. Этот метод используется в системах со стеклянными бусами (разд. 3.6.1) и оказывается особенно эффективным в системах с микроносителями (разд. 3.6.3). [c.70]

Когда клетки растут на мелких сферических носителях, они могут рассматриваться как клеточные суспензии и для их выращивания могут применяться процессы и аппаратура, разработанные для суспензионных культур. Культивирование клеток на микроносителях было впервые предложено Ван Везелем [16], использовавшим гранулы декстрана (сефадекс А-50). Полученные результаты не были полностью удовлетворительными из-за неподходящего заряда гранул, а также, по-видимому, вследствие токсических эффектов. Однако проведенная с тех пор большая исследовательская работа привела к тому, что в настоящее время в широкой продаже имеются многие типы подходящих микроносителей (табл. 3.3). [c.87]

Культуры инкубируют в увлажненном термостате при 37 °С и 5% СОг. Мы обычно заворачиваем чашки в пластиковую пленку для предотвращения циркуляции воздуха, что существенно снижает вероятность контаминации микроорганизмами. Через 24 ч клетки ресуспендируют в лунках и неприкрепив-шиеся клетки удаляют полностью, заменяя культуральную среду на свежую. Истощенную среду вновь полностью заменяют на 5-й и 9-й день инкубации. Конфлюентный слой прикрепившихся клеток обычно получают через 10—12 дней культивирования. К этому времени культуральную среду заменяют 2 мл полной среды RPMI 1640, содержащей гидратированный микроноситель ytodex 1 в концентрации 1 мг/мл. Оседая, гранулы микроносителя образуют правильный монослой. Инкубацию продолжают еще 4 дня, в течение которых клетки со дна лунок распространяются по поверхности микроносителя. Когда слой клеток на микросферах становится конфлюентным, культуры готовы к заселению предшественниками В-клеток. [c.246]

Число копий плазмид, введенных в клетки OS, достигает максимума через -48 ч после трансфекции. Далее внутриклеточный уровень плазмидной ДНК начинает постепенно снижаться из-за ее цитопатического действия и гибели клеток. В результате системы, основанные на клетках OS, не могут быть использованы для крупномасштабной наработки рекомбинантных белков в течение длительного времени. Максимальное внутриклеточное содержание рекомбинантных белков в этих системах наблюдают через 72 ч после трансфекции, и их синтез продолжается в течение последующих 5-10 дней на фоне медленного снижения количества клеток в культуре, что позволяет все же использовать клетки OS для препаративного синтеза рекомбинантных белков. Для этого одновременно трансфецируют до 10 клеток, выращивают их на роллерах или микроносителях, проводя многократный сбор культуральной жидкости. Такой подход позволяет получать до нескольких миллиграммов рекомбинантного белка из вышеописанного пула трансформированных клеток. [c.181]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология