Культуры клеток, среды и буферы

Клет <и (обычно из 5 мл культуры в экспоненциальной фазе роста) осаждают центрифугированием, промывают равным объемом Ка-ацетатного буфера, ресуспендируют в 1 мл раствора азотистой кислоты и инкубируют при 30—37° в течение определенного времени. Время обработки подбирают предварительно таким образом, чтобы выживаемость клеток составляла 0,01—0,1%. Клетки обрабатывают азотистой кислотой в течение 10—20 мин. После окончания инкубации к клеткам добавляют 5—10 мл минимальной среды, чтобы остановить реакцию. Затем клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 10 мл богатой питательной среды и выращивают в течение ночи. [c.178]

Для изоляции одиночных колоний трансформированных клеток, как правило, используют специальный цилиндр для клонирования, изготовленный из нержавеющей стали или стекла (внутренний диаметр цилиндра составляет 5 мм). Высота цилиндра не должна превышать 10 мм. На оба края цилиндра перед его автоклавированием наносят немного вакуумной смазки. Выбирают культуры, отсасывают питательную среду, клетки промывают ТД-буфером (предварительно подогретым до 37 °С). Затем тщательно удаляют буфер и помещают цилиндр на хорошо изолированную колонию, пользуясь прокаленным пинцетом. В цилиндр вносят каплю смеси трипсина с версеном, которая не растекается благодаря вакуумной смазке. Чашку закрывают и инкубируют в течение нескольких минут, наблюдая в микроскоп за состоянием клеток. Затем в цилиндр добавляют 3 капли среды, содержащей 5% ЭТС, ресуспендируют клетки пипетированием и переносят суспензию в новую чашку диаметром 3 см, содержащую 2 мл той же среды. Аналогичные операции проводят еще с 2—3 другими колониями. [c.246]

В случае культур, выращенных на твердой среде, нет необходимости использовать центрифугу или другие средства для сбора клеток, поскольку в этих культурах клетки находятся уже в сконцентрированном состоянии. Вместо этого на поверхность агара пипеткой наливают небольшое количество стерильного солевого раствора или буфера и суспендируют в нем выросшие колонии с помощью стерильного стеклянного шпателя. Таким способом можно получить большое количество клеток с поверхности агаровых сред в чашках Петри, в больших плоских культуральных матрасах (бутылях типа РУ) и в больших плоских чашках (покрытых крышками из пирекса). Особенно следует избегать центрифугирования при получении большого количества патогенных или [c.362]

Рис. 2. Прямой анализ продуктов, секретируемых гибридными клетками. Культуры гибридом получали, проводя слияние спленоцитов мышей, иммунизированных линией опухолевых клегок человека, с клетками мышииой мне ломы Х63-Аё8. Взвесь, содержащую 5-10 клеток гибридомы в 1 мл, культивировали в течение ночи в полной среде для тканевых культур в присутствии 100 мкКи/мя 5-метионина. Культуральную жидкость центрифугировали 15 мин при 20 000 Затем 100 мкл надосадочной жидкости смешивали перед ДСН-ПАГЭ с 50 мкл 3-кратного концентрата ДСН-буфера для образца. На гель наносили пробы по 50 мкл. Электрофорез проводили при постоянном токе 25 мА на пластинку геля в течение 3,5 ч. Т и Л —соответственно тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов 1 и — окрашенные элек трофореграммы и радиоавтографы одних и тех же образцов. Стрелками указаны легкие цепи пмм ко лобулино8, кодируемые геномом клеток Х63-Ай8.

Монослойная культура может быть перенесена во второй культуральный сосуд после диссоциации клеток монослоя трипсином и разведения. В случае субкультивирования суспензионных культур достаточно только разведения. Диссоциация клеток монослойной культуры достигается лучше всего промыванием монослоя фосфатным солевым буфером (ФСБ) или ФСБ с 1мМ этилендиаминтетраацетатом (ЭДТА) и последующей инкубацией с холодным раствором трипсина (0,25%-ный неоч11-щенный или 0,01—0,05%-ный очищенный) в течение 30 с. После этого трипсин удаляется, клетки инкубируют дополнительно в течение 15 мин. Затем клетки суспендируют в среде, определяют их количество и рассевают на новые флаконы. [c.23]

Аэробную культуру выращивают в течение ночи (15— 17 ч при 37 °С) в указанных выше условиях, клетки собирают центрифугированием, суспендируют в стерильном 0,05 М калий-фосфатном буфере, pH 7,5 (или физиологическом растворе), и инокулируют ими среды, состав которых дан в табл. 18.2 (в 125-мл колбы). [c.419]

IV. Сбор клеток. Для многих типов клеток сбор их с микроносителей оказывается весьма трудной задачей, если клетки не достигнут высокой плотности на гранулах. К сожалению, нет оснований ожидать многослойного роста клеток на микроносителях это случается крайне редко. Сбор клеток начинается с удаления среды, по крайней мере одноразовой промывки гранул с клетками буфером и суспендирования микроносителей с клетками в растворе соответствующего фермента. Культура затем перемешивается при высокой скорости (75—125 об/мин) в течение 20—30 мин. Если клетки открепятся, то значительная их часть может быть собрана, если дать гранулам осесть в течение [c.90]

Раствор Эрла — более емкий буфер. Однако в средах на его основе культивирование можно вести в плотно закрытых сосудах лишь тогда, когда в ходе метаболизма клетки продуцируют адекватное количество СОг. В противном случае (при клонировании, например) культивирование ведут в допускающих газообмен сосудах, помещенных в СОг-инкубатор, где поддерживается заданный уровень СОг (обычно 5—10 %). Технические трудности, а также проблемы, связанные со значительными изменениями pH при манипуляциях с культурами вне СОг-инкубатора, стимулируют поиск альтернативных буферных систем. Можно поддерживать pH, повышая концентрацию аминокислот. [6), а также заменяя бикарбонат р-глицерофосфатом [c.46]

Адгезивность и инвазивность определяют на культурах тканей Нвр-2 или НеЬа (см. подразд. 1.3.4, 3.1). Для этого бульонную культуру бактерий в логарифмической фазе суспензируют в культуральной среде и в строго определенном количестве вносят в емкости с монослоем эукариотических клеток. Через 3 ч инкубирования при 37 °С в присутствии СО2 клетки ткани отмывают фосфатным буфером, фиксируют и окрашивают (для определения индекса адгезивности) или покрывают свежей культуральной средой, содержащей гентамицин (для уничтожения внеклеточно расположенных бактерий), и продолжают инкубировать в течение 1 ч, после чего многократно промывают монослой, фиксируют и окрашивают его клетки (для определения индекса инвазивности). Индексы вычисляют как среднее количество микробных клеток, взаимодействующих с одной эукариотической (при этом изучают не менее 100 эукариотических клеток в препарате). [c.144]

Выделение риккетсий на культуре ткани. Клинический материал в объеме 0,5 мл смешивают с таким же количеством среды для культуры ткани и сразу же вносят в ячейки специальных планшетов или контейнеры, где предварительно выраш,ивают монослой соответствуюш,ей культуры клеток. Планшет центрифугируют в течение 1 ч при 700 g, после чего инокулюм удаляют, тщательно промывают ячейки с монослоем фосфатным буфером, вносят в них среду МЕМ с 10 % телячьей сыворотки крови и инкубируют при 34 °С в атмосфере 5 % СОз. Через 48 и 72 ч культуральную жидкость сливают, монослой промывают, фиксируют и окрашивают соответствующими люминесцирующими сыворотками (прямая РИФ) для обнаружения возбудителя в клетках монослоя. При люминесцентной микроскопии обнаружение четырех и более характерно светящихся микроорганизмов расценивается как положительный результат. Идентификацию выделенных риккетсий проводят также методом ПЦР с амплификацией генов, специфичных для риккетсий (например, гена цит-ратсинтазы, белка 17 кДа, ОтрВ — для определения родовой принадлежности, белка ОтрЛ — для выявления риккетсий сыпного тифа). [c.236]

В СССР в качестве источника фосфорилирующего фермента предложен щтамм Pseudomonas. Культуру предварительно выращивают на среде, содержащей глюкозу, пептон, дрожжевой экстракт. В качестве ферментного препарата, осуществляющего реакцию, используют живые клетки, высушенные под вакуумом или ацетоном, а также замороженные клетки, поскольку локализация фермента внутриклеточная. Из названны-х выше доноров фосфата лучшим считается п-нитрофенилфосфат. Реакция происходит в ацетатном буфере, при pH 4,0, в присутствии ионов меди и цинка, заметно усиливающих выход продукта. [c.357]

Нитрозогуанидин. Ы-метил-М-нитро-Ы-нитрозогуанидин (НГ) является одним из самых мощных и широко применяемых мутагенов. Исходные растворы НГ готовят непосредственно перед использованием, растворяя его в соответствующем буфере (например, 0,1 М цитратный буфер, pH 5,5) до концентрации 1 мг/мл. Рабочая концентрация НГ составляет обычно 50—500 мкг/мл. Клетки (обычно из 5 мл культуры в экспоненциальной фазе роста) осаждают центрифугированием, промывают равным объемом нитратного буфера, ресуспендируют в 5 мл буфера, добавляют НГ и инкубируют при 30—37° в течение определенного времени. Время обработки подбирают предварительно таким образом, чтобы выживаемость клеток составляла примерно 50%. Клетки обрабатывают НГ в конечной концентрации 50—100 мкг/мл в течение 30 мин. Обработанные клетки осаждают центрифугированием, промывают фосфатным буфером (pH 7,0) или минимальной средой (см. Приложение), чтобы удалить НГ. После этого клетки переносят в богатую питательную среду (см. Приложение) и инкубируют в течение ночи (12—16 ч). [c.175]

Клетки инкубируют при 28 °С. Если среда содержит в качестве буфера бикарбонат натрия, культуру инкубируют во влажной камере в атмосфере 5% СОг, причем проби в культуральных сосудах закрывают неплотно. [c.74]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология