Среды для культивирования гибридом

Наиболее простым способом оценки специфичности моноклональных антител в процессе клонирования гибридом является метод непрямого твердофазного иммуноферментного анализа с применением Т8Р-планшетов. ТЗР-планшеты представляют собой полисти-рольные стерильные крышки к 96-луночным культуральным платам, имеющие выступы, опускающиеся в лунки. Поверхность выступов ТЗР-планшетов может быть покрыта в стерильных условиях антигеном. Планшетом накрывают плату, в которой выращивают гибридомы таким образом, чтобы покрытые антигеном выступы опустились в среду культивирования гибридом. Выдерживают 1 ч и заменяют на новый планшет, выступы которого покрыты перекрестно реагирующим антигеном. Дальнейшую обработку ТЗР-крышек проводят в соответствии со стандартной методикой для непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. Используя этот метод, можно в течение одного дня провести оценку способности моноклональных антител взаимодействовать с перекрестно реагирующими антигенами. Это дает возможность уже через 12—15 дней отобрать и клонировать только те гибридомы, которые обладают нужной исследователю специфичностью. [c.172]

Полуколичественная оценка /50 на ранних стадиях культивирования гибридом может быть осуществлена методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. В лунки платы для миКро-титрования, покрытые антигеном, использованным для получения моноклональных антител, помещают по 25 мкл растворенного в фосфатно-солевом буфере с тритоном перекрестно реагирующего антитела, концентрацию которого варьируют от 1 10 до 1 10 М. Затем в каждую лунку добавляют 25 мкл среды культивирования гибридом, разведенной в 2 раза буфером, содержащей моноклональные антитела. Аналогичным образом параллельно титруют исходный антиген, к которому были получены моноклональные антитела. В качестве контроля титрование сходного и перекрестно реагирующего антигенов осуществляют в присутствии 25 мкл разведенной в 2 раза среды культивирования гибридом, не содержащей моноклональных антител. Контрольные и опытные образцы инкубируют 1 ч при 37°С, а затем обрабатывают планшеты по методике для проведения непрямого твердофазного иммуноферментного анализа. [c.173]

Наращивание гибридом. Клоны, которые оказались положительными, наращивают, пока они не займут Vз поверхности 96-луночной платы. После этого их переносят в лунки 24-луночных плат, содержащих по 1 мл ростовой среды. Через несколько дней клетки из нескольких лунок этих плат объединяют и переносят в 50 мл флаконы для культивирования. Оптимальная для роста плотность клеток — 500 тыс. на 1 мл. После этого клетки могут быть помещены в сосуды для культивирования объемом 250 мл и более. [c.168]

Оптимальный pH среды должен быть близок к 7,4 в начале культивирования и пе снижаться ниже 7,0 в ходе культивирования. Однако для многих линий гибридом оказывается предпочтительным pH около 7,0. При pH ниже 6,8, как правило, наблюдается подавление роста клеток. Среди факторов, влияющих на стабильность pH, следует отметить тип буфера и его емкость, объем воздушного пространства культуры и концентрацию глюкозы в среде. [c.65]

При длительном пассировании гибридом в культуре следует иметь в виду их высокую чувствительность к условиям культивирования. К ним относятся качество посуды, состав среды, pH, плотность культуры и др. Лимитирующей размножение является как высокая, так и низкая плотность культуры. В переросших культурах накапливаются токсические вещества и клетки быстро погибают. Существенное значение в контроле размножения имеет pH среды. При повышении pH деление клеток прекращается. При восстановлении pH до оптимальных значений (pH 7.5—7.6) происходит восстановление клеточной пролиферации, однако время этого восстановительного периода является функцией времени, в течение которого клетки находились в среде с щелочными pH 5 сут после 24-часового пребывания при pH 8.3 и 11 сут после 72 ч [4]. [c.202]

Клетки питающего слоя. Техника получения гибридом в сущности представляет собой выращивание клеточного потомства из одной клетки, посеянной при очень низкой плотности. Известно, что при низкой плотности рост клеток сильно замедляется и в значительной степени определяется наличием в среде в достаточном количестве различных питательных и стимулирующих факторов. В связи с этим при получении гибридом часто используют клетки питающего слоя (feeder ells), которые снабжают культуру различными жизненно необходимыми факторами. Этот эффект будет проявляться тем сильнее, чем менее оптимальной является среда культивирования. При использовании некоторых партий сывороток и сильно обогащенных сред эффект клеток питающего слоя может и не выявляться. [c.105]

Клонирование в полужидком агар-агаре. Для клонирования гибридом можно применять полужидкий агар (Р. offino и сотр., 1972). Обычно берется система, состоящая из двух слоев. Нижний (твердый) слой содержит 0,5% агар-агара в среде культивирования. Ему дают затвердеть. Затем добавляют второй слой — мягкий, содержащий 0,3% агар-агара, в который включаются клонируемые клетки. При использовании клеток питающего слоя их засевают в чашку Петри до заливки агар-агара, и среду культивирования удаляют непосредственно перед добавлением нижнего слоя агара. [c.110]

Одновременную инкубацию обоих конкурентов (меченого и немеченного миозина) с первичными антителами использовали Кларк и соавторы для отбора моноклональных гибридбм — продуцентов антител против миозина. Роль иммунной сыворотки в этих опытах каждый раз играли среды культивирования различных гибридом, полученных в результате слияния клеток селезенки крыс и мышей, иммунизированных миозином, и клеток миеломной линии P3-X63-Ag8. Инкубацию проводили в боратном буфере (pH 8,4), содержащем 40 мМ пирофосфата натрия, по 1% Тритона Х-100 и дезоксихолата, а также 2% нормальной сыворотки крысы или мыши. Эту сыворотку вводили опять-таки ради создания эквивалентного соотношения концентраций при последующем добавлении вторичных антител в составе анти сыворотки козы против иммуноглобулинов крысы или мыши Использовав для конкуренции миозин гомологичного и гетеро логичного происхождения, авторы выясняли степень специфич ности антител, синтезируемых гибридомами [ lark et al., 1980] [c.282]

Для культивирования гибридом in vitro в основном используют два подхода. При одном из них гибридомы выращивают в течение 10 дней в виде суспензионных клеточных культур на искусственных питательных средах в присутствии фетальной телячьей сыворотки в качестве источника факторов роста. В ряде случаев гибридомы удается адаптировать к росту в бессыворо-точных средах. Концентрация mAb в таких средах к моменту завершения культивирования достигает 10 мг/мл. mAb можно сконцентрировать и очистить стандартными хроматографическими методами, включая аффинную хроматографию на колонках с иммобилизованными протеином А или протеином G, однако некоторые антитела не переносят таких манипуляций и денатурируют, утрачивая свою активность. [c.405]

Культивирование гибридом in vitro. Продукция антител при рутинных способах культивирования in vitro является низкой (единицы—десятки микрограммов на 1 мл). Преимуществом этого метода является упрощение процедуры очистки антител. Кроме того, низкая концентрация антител, присутствующих в культуральной среде, оказывается достаточной для проведения некоторых тестов с использованием моноклональных антител. [c.202]

Основными компонентами заменителей сыворотки являются транспортные белки, липиды, гормоны, агенты, стимулирующие секрецию антител, и др. Эти компоненты добавляются к среде определенного химического состава. В нашей лаборатории для культивирования гибридом применяется среда, предложенная Мураками и соавторами [11]. В качестве базовой среды используется смесь среды F-12 и DME (1 1). К ним добавляются инсулин (5 мкг/мл), трансферрин (35 мкг/мл), этаноламин (0.02 М), селенит (2.5 10 М), HEPES (15 10 М). На такой среде гибридомы поддерживаются in vitro в течение многих пассажей и сохраняют продукцию антител. [c.202]

Кроме дифференциации клеток важной особенностью их является склонность к аггломерации (от лат agglomeratus — скопление) Это может происходить в различных условиях и с клетками различного уровня организации — прокариотами и эукариотами Те из них, которые имеют клеточную стенку, чаще аггломерируют за счет химических компонентов, локализованных в ней Причем процесс "скучивания" является физико-химическим (адсорбция, ионное и ковалентное взаимодействия), зависящим не только от особенностей клеток, но и от компонентов среды, используемой для их культивирования Поэтому аггломерация может быть следствием 1 адгезии (от лат айЬаезю — склеивание, слипание) клеток друг к другу или к поверхности культурального сосуда за счет веществ — адгезинов, расположенных на их поверхности, и других причин, 2 агглютинации по схеме "антиген-антитело", когда в качестве антигена оказываются культивируемые клетки, а в качестве антитела — гомологичные или гетерологичные агглютинирующие иммунные сыворотки, 3 слияния клеток с образованием гибридов [c.149]

Потенциальная контаминация названных выше продуктов возможна из рааллчных источников от лиц, чьи клетки используются в биотехнологических процессах, от миеломных клеток, применяемых для получения гибридов, из питательных сред для культивирования клеток млекопитающих, из реагентов, используемых для очистки белковых продуктов, например, моноклональные антитела, наконец, несоблюдение требований GMP [c.256]

В результате такого культивирования нами были получены триплоидные гибриды ржи. Преодоление соматопластической стерильности и успешное выращивание растений на питательных средах позволяют заключить, что абортивность семян обусловлена не генетическими нарушениями в зародышах а изменением процессов их питания. [c.130]

Разработаны приемы освобождения растительных клеток от твердых клеточных оболочек для получения культуры изолированных протопластов, отграниченных от окружающей среды одной только плазмалеммой. Изолированные протопласты получают в результате комбинированного действия ряда ферментов (пектиназы и целлулазы), которые гидролизуют клеточные оболочки. В результате возникает возможность более детального изучения внутреннего строения клетки. Культивирование протопластов приводит в дальнейшем к ресинтезу клеточных стенок и образованию обычной культуры клеток, из которой затем можно вновь регенерировать целое растение. Изолированные протопласты представляют также большой научный и практический интерес, поскольку, изменяя соответствующим образом состав питательной среды, можно стимулировать их слияние друг с другом, осуществляя таким образом процесс так называемой соматической (неполовой) гибридизации растительных клеток. Культивируемые затем в определенных условиях гибридные протопласты могут дать начало новому растению с признаками, унаследованными от обоих родителей. Соматическая гибридизация может применяться во всех случаях, когда получение гибридов обычным (половым) путем невозможно из-за ряда физиологических или цитогенетических барьеров между растениями, например при отдаленной гибридизации. [c.10]

Всех этих недостатков лишены кондиционированные среды, представляющие собой супернатанты культур, в которых росли клетки питательного слоя. Кондиционированные среды в культивировании клеток используются давно в качестве средства замены клеток питающего слоя. Для получения гибридом использовались среды, кондиционированные эпителием человека (G. Astaldi и сотр., 1980), клетками эндотелия (С. Pintus и сотр., [c.106]

СЛИЯНИЯ гибридом с родительскими миеломами, имеющими особенно благоприятные характеристики. Кроме того, большое поле деятельности открывается в области инженерии моноклональных антител. Эта технология позволит создавать новые типы моноклональных антител с заранее заданными свойствами и получать их в больших количествах. Необходимо также развивать методы скрининга для поиска клонов, секретирующих антитела при культивировании на бессывороточных средах. [c.50]

В том случае, когда клетки после слияния рассевают в лунки панели для культуры ткани объемом 2 мл, вероятность того, что в одной лунке окажется более одного клона, повышается. Просматривая культуры под инвертированным микроскопом, можно наблюдать два и более клонов в лунке. Клонирование клеток, продуцирующих антитела нужной специфичности, предпринимают немедленно после образования монослоя (обычно па 21—28-е сутки после гибридизации). Тем не менее гибридо-ыу продолжают наращивать в нескольких лунках, а затем во флаконах, пока не образуется достаточное для замораживания и хранения в жидком азоте количество клеток. Необходимо иметь, по меньшей мере, пять ампул исходной клеточной взвеси на случай, если возникнут трудности или неудачи при клонировании. Во время культивирования гибридомы во флаконах культуральную среду тестируют для выявления антител нужной специфичности. Если наблюдается прогрессирующее сни-жение образования антител на стадии роста культуры во флаконах, то это означает, что несекретирующие варианты гибридных клеток обогнали в росте антителообразующие клетки, В таком случае важно отобрать антителообразующие гибрид ные клетки путем клонирования, а небольшое количество клеток из этих флаконов сохранить для последующих процедур клонирования. Клонирование клеток из тех флаконов, где а культуральной среде выявляют прогрессивное снижение образования антител, почти всегда безуспешно. Если все же очень важно выделить такую клеточную линию, то следует извлечь из жидкого азота и разморозить образец клеток, замороженный на самой ранней стадии культивирования и сразу же после восстановления клеток в культуре провести клонирование. Клони-рование может быть осуществлено либо путем высевания небольшого количества клеток в мягкий агар, либо с помощью лимитирующих разведений. [c.139]

Выращенные таким образом в небольшом количестве культуры гибридных клеток проверяют на способность секретировать в питательную среду специфических антител и далее рассевают до отдельных клеток методом последовательных разведений. В результате, каждая клетка потенциально может стать родоначальницей клона, продуцирующего mAb требуемой специ-<4 ичности. Поскольку синтез антител в ряде случаев может быть токсичным для клетки-продуцента, вместо культивирования in vitro на этой стадии параллельно используют культивирование in vivo в виде асцитных опухолей у мышей. Отмечено, что непродолжительное культивирование in vivo в дальнейшем способствует стабилизации клеточных линий, продуцирующих mAb. Полученные таким образом, охарактеризованные клоны гибридом являются источником неограниченного количества mAb данной специфичности, которые можно получать, культивируя гибридомы в искусственной питательной среде или асцитной жидкости организма мышей. [c.405]

В качестве искусственной питательной среды используют среду Мурасиге —Скуга или среду В5. Осмотическое давление при культивировании клеток поддерживают при помощи глюкозы, сахарозы и других соединений. Плотность посева клеток 104—1Q5 кл/мл, объем культуры 2,5—10 мл. Агглютинирование протопластов до слияния осуществляют полиэтиленгликолем или центрифугированием. Соматические гибриды представляют собой новый источник для получения -исходного материала в селекции. [c.258]

Разработка и применение способов получения и слияния протопластов растительных клеток, а также регенерации у них клеточной стенки в сочетании с методами культивирования и диффе-ренцировки клеток in vitro позволили конструировать рекомбинанты, минуя половой процесс, т. е. создавать соматические гибриды. Как известно, процесс слияния протопластов неспецифичен. Слияние протопластов осуществляют в жидких средах с помощью полиэтиленгликоля. Это позволяет объединять протопласты отдаленных видов растений, между которыми половая гибридизация невозможна, и таким образом расширять круг растений, вовлекаемых в гибридизацию. [c.142]

В гибридных клетках человек-мышь, полученных в результате слияния ане-уплоидных Ь-клеток мыши и диплоидных эмбриональных фибробластов человека, 75-95% человеческих хромосом утрачиваются в процессе культивирования, причем их утрата носит случайный характер. Среди множества разнообразных гибридов всегда найдется клетка, сохравдвтая ту или иную хромосо.му человека. После размножения этой клетки можно провести анализ ферментов, активность которых связана с наличием именно данной хромосомы. Использование методов дифференциального окрашивания хромосом позволяет связать п ны с определенными локуса-ми хромосом, так как в гибридных клетках довольно часты хромосомные разрывы, перестройки, присутствие не целых хромосом, а отдельных фрагментов. [c.123]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология