Гибридные белки расщепление

Подходы к расщеплению гибридных белков [c.104]

Как описано в разд. 4.1, гибридные белки состоят из бактериального или синтетического полипептида, связанного с эукариотическим полипептидом. Обычно бывает нужно выделить только эукариотический белок. Для этого используется следующий подход. Конструируют гибридный ген, в продукте которого имеется точка расщепления, расположенная между участком цепи, кодируемым бактериальной иЛи искусственно синтезированной последовательностью, и участком, кодируемым последовательностью эукариотического гена. Было описано множество подходов, решающих проблему расщепления, которые грубо можно разделить на два типа химические и ферментативные (табл. 4.5). Выбор конкретного подхода определяется свойствами чужеродного белка, идеальная ситуация — это возможность использования сайта расщепления, отсутствующего в последовательности чужеродного белка. [c.104]

Таблица 4.5. Возможные варианты расщепления гибридных белков

Таблица 4.7. Расщепление бромистым цианом гибридных белков Р-галактозидаза-А-цепь инсулина и -галактозидаза—В-цепь инсулина

Таблица 4.9. Расщепление трипсином гибридного белка -галактозидаза— -эндорфин

Таблица 4.10. Расщепление гибридного белка Я,с11—р-глобин фактором свертывания крови Ха

Таблица 4.6. Кислотное расщепление гибридных белков TrpLE-бГР

В случае полипептидов, не содержащих метионина, для образования составного белка обычно используют метиониновую сшивку, которую в будущем можно расщепить бромистым цианом. Одним из примеров такого подхода служит присоединение р-галактозидазы к А-и В-цепям инсулина [11] соответствующая методика приведена в табл. 4.7. Гены гибридных белков, содержащих А- и В-цепи, клонированы и экспрессируются по отдельности. Перед расщеплением бромистым цианом агрегировавшие белки инкубировали в 6 М гуанидинхлориде и 1%-ном (объемная концентрация) 2-меркаптоэтаноле. Такая обработка должна приводить к развертыванию молекул гибридных белков и ослаблению всех имеющихся внутримолекулярных или межмоле-кулярных дисульфидных связей. Опять же такая предварительная обработка может оказаться необходимой, чтобы связь ме-тионин-Х стала доступной для расщепления. [c.106]

Как правило, гибридные белки конструируются таким образом, чтобы они содержали уникальные точки расщепления. Так, например, в кальцитонине нет остатков аргинина, и, следовательно, можно осуществить расщепление, катализируемое клострипаином, не рискуя расщепить заодно и эукариотический полипептид. [c.108]

Таблица 4.12. Очистка и расщепление гибридного белка урогастрон—полиаргинин

Таблица 4.17. Анализ кальцитонина человека, полученного в результате расщепления пептидазой из клостридий гибридного белка AT—кальцитонин

В клетках Е. oli была осуществлена также экспрессия белков, содержащих большое число субъединиц, и осуществлено их выделение из нерастворимых комплексов. Для получения мутантных гемоглобинов осуществляли синтез в клетках Е. соИ Р-глобина в виде гибридного белка р-галактозидаза — р-глобин и выделяли этот белок методом, описанным в разд. 4.3.2.2 [23] (табл. 4.10). После расщепления гибридного белка, диализа и лиофилизации конформацию гемоглобина восстанавливают, используя следующую методику [23]. [c.125]

На сегодня существуют три способа конструирования, обеспечивающие трансляцию чужеродной генетической информации в клегках бактерий. Первый способ — внедрение чужеродного структурного гена, лишенного собственных регуляторных областей, внутрь хорошо экспрессируемого бактериального гена. Точка внедрения должна быть достаточно удалена от места инициации трансляции, чтобы новая нуклеотидная последовательность не мешала эффективной инициации транскрипции и трансляции бактериального гена. При такой конструкции можно ожидать, что уровень экспрессии гибридного белка будет близок уровню экспрессии исходного гена. Недостаток метода — трудность последующего расщепления гибридного белка и выделения конечного продукта (рис. 28, а). [c.157]

Проблема внутриклеточной стабильности рекомбинантных белков больше связана с деградацией небольших пептидов, поскольку крупные нативные белки более стабильны в бактериальных клетках. Один из подходов, позволяющих стабилизировать короткие чужеродные пептиды в клетках Е. соН, - включение требуемого пептида в состав гибридного белка. В этом случае последовательность нуклеотидов, кодирующую гибридный белок, соединяют в составе экспрессирующего вектора в одной рамке считывания с бактериальным геном, кодирующим белок (например, геном -галактозидазы). Образующийся в результате экспрессии такого рекомбинантного гена гибридный белок в своем составе содержит в N- или С-концевой части требуемый пептид, защищенный основным белком-носителем от протеолитической деградации. Для отделения пептида от белка-носителя их соединяют друг с другом последовательностью аминокислот, по которой можно провести специфическое расщепление полипептидной цепи. В том случае, если пептиды не содержат метионина, соединение белка-носителя и пептида осуществляют через эту аминокислоту, и отщепление пептида производят с помощью бромистого циана. Такой подход был использован, например для получения рекомбинантного соматостатина, а также А- и В-цепей инсулина. [c.117]

В генетической инженерии с целью получения белков в достаточных количествах и с заданными свойствами (например, для генотерапии наследственных и соматических болезней) широкое применение получили эндонуклеазы рестриктазы, катализирующие расщепление молекулы двухцепочечной ДНК по специфическим нуклеотидным последовательностям внутри цепи. Рестриктазы узнают определенные 4-7-членные последовательности, вызывая, таким образом, разрывы в определенных сайтах цепи ДНК. При этом образуются не случайные последовательности, а фрагменты ДНК строго определенной структуры с липкими концами (рекомбинантные ДНК), используемые далее для конструирования гибридных молекул и получения генно-инженерной, биотехнологической продукции (например, инсулина, гормона роста, интерферона, вакцин против вируса гепатита В, СПИДа и др.). [c.481]

Вирус ВИЧ в составе зрелой внеклеточной частицы содержит геномную молекулу РНК. Однако развитие вирусной инфекции связано с этой РНК лишь в самой начальной фазе. По информации, содержащейся в этой РНК, воспроизводится молекула ДНК, сначала однонитевая. Затем на ней, как на матрице, воспроизводится комплементарная цепь и образующаяся двунитевая ДНК встраивается в геном инфицированной клетки. Именно эта ДНК далее управляет синтезом копий мРНК, необходимых для программирования синтеза вирусных белков, и самой РНК вириона, которая должна входить в состав новых вирусных частиц. Исходная же РНК при синтезе ДНК постепенно уничтожается с помощью активности, известной под названием РНКазы Н. Этот фермент катализирует гидролитическое расщепление РНК в составе гибридного дуплекса РНК-ДНК. Таким образом, для формирования двунитевой ДНК копии геномной РНК вируса ВИЧ-1 необходимо проявление трех активностей обратной транскрипции для синтеза однонитевой ДНК, ДНК-полимеразной активности для получения двунитевой ДНК и, наконец, активности РНКазы Н. Оказывается, все эти активности присущи самой обратной транскриптазе вируса БИЧ-1. Однако самое удивительное состоит в том, что переключение активностей проис.ходит строго упорядоченно, это не просто три параллельно работающих активных центра на одном ферменте. Последовательность происходящих событий представлена на рис. 68. Рассмотрим ее более подробно. [c.225]

Первая контролируемая модификация белка была проведена в середине 60-х годов Кошландом и Бендером. Для замены гидроксильной группы на сульфгидрильную в активном центре протеазы — субтилизина они применили метод химической мо дификации. Однако, как выяснилось, такой тиолсубтилизин не сохраняет протеазную активность. Вообще говоря, методы химической модификации не только жестки и неспецифичны они плохи еще и тем, что с их помощью невозможно вызвать множественные желаемые изменения, особенно если модифицируемые аминокислотные остатки погружены в глубь третичной структуры белка. Для этого нужна белковая инженерия, основанная на генетической инженерии. Сегодня она осуществляется при помощи двух хорошо освоенных методов (гл. 7). Так, сайт-специфический мутагенез осуществляется следующим образом. Клонируют ген того белка, который интересует исследователя, и встраивают его в подх.одящий генетический носитель. Затем синтезируют олигонуклеотидную затравку с желаемой мутацией, последовательность которой из десяти — пятнадцати нуклеотидов в достаточной степени гомологична определенному участку природного гена и поэтому способна образовывать с ним гибридную структуру. Эта синтетическая затравка используется полимеразами для начала синтеза комплементарной копии вектора, которую затем отделяют от оригинала и используют для контролируемого синтеза мутантного белка. Альтернативный подход основан на расщеплении цепи, удалении подлежащего изменению сайта и замещении его синтетическим аналогом с желаемой последовательностью нуклеотидов. [c.183]

До сих пор рассматривалась лишь ассоциация идентичных белковых молекул. Однако строго определенные комплексы могут образовываться и из различных компонентов. Важным случаем взаимодействия этого тина является гемоглобин человека и высших млекопитающих. В целом он состоит из четырех субъединиц, которые при низких значениях pH могут быть отделены одна от другой [983, 984]. Эти субъединицы попарно подобны, причем подобные пары в менее диссоциирующей среде, по-видимому, существуют в виде димеров [985, 986]. Асимметричное расщепление гемоглобина — обратимый процесс, и строительные блоки гемоглобина различного происхождения (значительно различающегося по своему химическому составу) могут рекомбинироваться с образованием гибридного гемоглобина [987]. Расшифровка кристаллической структуры гемоглобина подробно объяснила способ точной укладки четырех субъединиц и позволила сделать вывод о наличии строго определенной четвертичной структуры белка. Аналогичное положение, по-видимому, наблюдается и для фермента — триптофансинтетазы, который создается в некоторых живых организмах в виде двух различных белков. После разделения этих двух белков они проявляют совершенно различную каталитическую активность в процессе ассоциации, приводящей к образованию комплекса [988, 9891. Экспериментальные данные позволяют высказать предположение о том, что каждая субъединица комплекса несет часть ферментативного центра, и, таким образом, две субъединицы должны соответствовать друг другу точно установленным геометрическим образом. Подобное явление представляет образование комплекса из трех или четырех ферментов, которые катализируют ряд реакций, приводящих к дегидрогенизации а-кетокислот [990]. Этот комплекс исключительно устойчив и диссоциирует с большим трудом. Очевидно, такая ассоциация ферментов, участвующих в катализе последовательности метаболических процессов, с биологической точки зрения более предпочтительна, так как она устраняет необходимость обновления комплекса фермент-субстрат для каждой стадии реакции. [c.337]

Несколько раз в инфицированных клетках наблюдали пептидно-расщепленный NS2 [77, 128, 178, 257, 268] позднее на основании его пептидного строения и штаммоспецифических различий при миграции в ПААГ было показано, что NS2 представляет собой вирускодируемый уникальный полипептид. Эти наблюдения привели к предположению, что один сегмент вирионной РПК кодирует два белка [139]. NS2 транслируется с отдельной маленькой мРНК [111, 134], а эксперименты по гибридно-остановленной трансляции и анализ рекомбинантов определенного геномного строения выявили, что NS2 закодирован 8-м сегментом РНК [111, 134] fia основании оценок размера 8-го сегмента РНК, размеров двух [c.55]

Второй путь — создание гибридного сайта связывания с рибосомами. В этом случае проводят расщепление в молекуле бактериальной ДНК между последовательностью SD и кодоном инициации. Чужеродный структурный ген несет собственный кодон инициации и несколько нуклеотидов перед ним. Объединение in vitro таких конструкций дает гибридный сайт связывания с рибосомами (рис. 28,6). Преимущество метода состоит в том. что в клетке синтезируется нормальный полноразмерный чумеродный белок. Недостаток связан с тем, что нельзя создать унифицированный, подходящий для всех белков гибридный сайт инициации трансляции. Это обстоятельство сопряжено с необходимостью оптимизации вторичной структуры мРНК. На практике в каждом случае варьируют расстояние от SD до AUG и меняют нуклеотиды между ними. [c.157]

В заключение этого раздела следует упомянуть о возможности использования транс-сплайсинга белков для исследования белок-белковых взаимодействий в цитозоле прокариотических и эукариотических клеток [72, 73]. При таком подходе получают гибридные рекомбинантные белки путем слияния половинок зеленого флуоресцирующего белка (GFP) или люциферазы с двумя фрагментами расщепленного интеина. Другой конец одного из фрагментов интеина соединяют с белком-рецептором (приманкой), как это делается в классических системах дигибридного скрещивания у дрожжей, а у другого фрагмента - с большим количеством потенциальных белков-лигандов. В том случае, если между рецептором и лигандом происходит взаимодействие, два фрагмента интеинов объединяются друг с другом (см. выше, рис. 41) и осуществляют транс-сплайсинг, завершающийся образованием полноценного флуоресцирующего белка или люциферазы, что легко обнаруживается по изменению уровня флуоресценции инкубационной смеси. [c.316]

Двухцепочечный олигонуклеотид (а), содержащий вырожденные кодоны NNK и те же самые сайты рестрикции в составе линкеров, лигируют с ДНК вектора Fuse5 (б), расщепленного рестриктазой Sfil, с образованием рекомбинантного генома (в), который направляет синтез гибридного рекомбинантного белка (г), содержащего на N-конце указанную аминокислотную последовательность [c.341]

По участку loxP плазмидная ДНК может быть расщеплена белком Сге фага Р1, по os-участку — соответствующим ферментом фага Я. Такие участки удобны для строго специфичного расщепления гибридных плазмид, мечения полученных концов и последующего рестрикционного картирования клонированных фрагментов изучаемого генома. [c.108]

Прежде всего была создана плазмида, имеющая в своем составе слитые части генов lad и la Z при транскрипции и трансляции такого химерного гена образуется белок с ферментативной активностью /З-галактозидазы. Слитый ген la l - Z в плазмиде pLG (рис. 3.8) не имеет промотора и поэтому не экспрессируется. Встройкой линкеров в начало структурной части этого гена можно вводить различные места узнавания рестриктаз. Для каждого конкретного случая выбирается определенная последовательность нуклеотидов вводимого линкера. Если по выбранному месту расщепления рестриктазой встроить последовательность любого гена X, кодирующую N-шнцевую часть полипептида, то образованный гибридный ген будет детерминировать синтез химерного белка, по-прежнему обладающего ферментативной активностью )3-галактозидазы. ДНК полученной [c.151]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология