Периодические методы определения активности ферментов

Для иллюстрации изложенных в предыдущем разделе обш их соображений и возможностей использования различных аффинных сорбентов рассмотрим определенное число примеров, отобранных из периодической научной литературы последних трех лет. Большая их часть относится к очистке ферментов клеточного метаболизма (и отдельно — белков, регулирующ,их активность нуклеиновых кислот). Далее будут приведены примеры аффинного фракционирования и очистки самих нуклеиновых кислот, в том числе на иммуносорбентах. Основное внимание уделим более простому и универсальному методу — неспецифической элюции, однако био-снецифическая аффинная элюция белков тоже будет представлена несколькими типичными примерами. Рассмотрение начнем с использования сорбентов с индивидуальной специфичностью, ограничившись здесь тремя примерами, поскольку нет смысла пытаться сколько-нибудь полно иллюстрировать бесчисленное разнообразие возможных сорбентов этого типа. Аффинная хроматография белков клеточного метаболизма на сорбентах с групповой специфичностью будет иллюстрирована подробнее, а затем последуют два примера использования ковалентной хроматографии. [c.412]

Активность иммобилизованных ферментов можно определить практически всеми известными методами (непрерывными и периодическими, спектрофотометрическими, рН-метрическим, флуоресцентными, химическими и др.). При работе с иммобилизованными ферментами не-> обходимо постоянно перемешивать реакционную смесь в процессе из--мерения активности, так как в противном случае по мере оседания частиц носителя активность будет уменьшаться. При определении активности ферментов методом отбора проб обычное осаждение белка (например, трихлоруксусной кислотой) в случае иммобилизованных препаратов можно заменить отделением фермента фильтрованием или центрифугированием. [c.298]

Как видно, в проточном режиме продуктивность культуры по биомассе в 17 раз и по продукту в 6 раз превышает продуктивность периодического процесса. Во время ферментации активность глюкоамилазы увеличивается до 50—80 ед/мл. При определении глюкоамилазной активности (ГА) глюкооксидазным методом за единицу активности принимают такое количество фермента, которое вы5ывает образование 1 мг глюкозы из растворимого крахмала за 1 ч при температуре 30°С. [c.198]

Чтобы измерить активность фермента, необходим метод определения количества образовавшегося продукта (или иногда количества израсходованного субстрата). Такой метод может включать стадию разделения субстратов и продуктов после реакции можно также измерять концентрацию одного из компонентов смеси независимо от присутствия другого. Удобно разделить способы измерения активности ферментов на две группы периодические (stopped) и непрерывные методы. Последние будут рассмотрены в следующем разделе. Непрерывные методы позволяют следить за ходом реакции во времени, не прерывая ее течения, что является большим преимуществом. Однако непрерывные методы имеют ряд ограничений, и для многих ферментов нет подходящих способов таких измерений. Периодиче- [c.286]

При периодическом способе определения активности фермент инкубируют с его субстратом в течение определенного периода времени, и затем реакцию останавливают каким-либо образом. Измеряют количество образовавшегося продукта исходя из предположения, что скорость реакции изменялась линейно в течение всего периода инкубации начиная с нулевого времени. Первое, что нужно проверить при использовании периодического метода, это предположение о линейности. Одна точка может дать заниженное значение начальной стационарной скорости реакции, если к тому времени, когда реакция была остановлена, ее скорость уже снизилась (рис. 8.4). С другой стороны, наличие лаг-периода в ходе ферментативной реакции также даст заниженное значение скорости, если ее определение основано на данных одного измерения. Чтобы проверить линейность изменения скорости реакции, необходимо провести серию инкубаций в течение разных периодов времени. Это особенно важно в случае использования неочищенных экстрактов тканей, так как при этом возможны многие побочные реакции. В результате продукт ферментативной реакции, который пытаются определить, может подвергнуться превращению под действием другого, следующего в метаболической цепи фермента. Более подробное обсуждение методов определения ферментативной активности в сырых тканевых экстрактах приводится в работе [167]. [c.287]

Рис. 14.2. Определение активности нитрогеназы по восстановлению ацетилена до этилена. А. Бактерии (в культуре или ассоциированные с корнями растения), синтезирующие нитрогеназу, либо препарат очищенного фермента (не показано) помещают в герметичную емкость в атмосферу ацетилена. Б. Из емкости периодически отбирают пробы и методом газовой хроматографии измеряют количество ацетилена и этилена. Активность нитрогеназы пропорциональна количеству обра-зовавщегося этилена.

Изложив принципы периодических и непрерывных способов определения ферментов, можно сравнить их относительные преимущества и недостатки. Это уже частично было сделано выше в табл. 8.3 дано систематическое их сопоставление. В заключение необходимо упомянуть о так называемом непрерывно-периодическом методе. Используя автоматическую систему тестирования ферментов, можно отбирать пробы из реакционной смеси и после остановки в них реакции измерять количество продуктов реакции, получая таким образом непрерывный ряд значений ферментативной активности. Пример, приведенный на рис. 8.13, показывает, каким образом этот метод применяется для тестирования фосфатобразующих ферментов. Таким же способом можно проводить множество других определений, которые раньше выполнялись только с помощью периодических методов. [c.306]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология