Измерение активности ферментов

Следует напомнить об известных трудностях идентификации функциональных групп активных центров ферментов по величинам рК, полученным из изучения зависимости скорости реакции от pH. Во-первых, одна и та же группировка в белках разного строения может иметь неодинаковое значение рК из-за влияния соседних групп. Некоторую помощь в этом случае может оказать измерение теплоты диссоциации ионогенных групп, рассчитываемой по измерениям температурной зависимости рК. К сожалению, для холинэстераз эти термодинамические константы достаточно надежно не измерены. Согласно данным Шукудза и Шинода [122], теплоты диссоциации основной группировки ацетилхолинэстеразы эритроцитов и холинэстеразы сыворотки крови человека составляют соответственно 8,5 и 6,5 ккал1моль. Эти величины выше или ниже найденной для диссоциации имидазольной группы гистидина в других белках (6,9—7,5 ккал моль [123]). Если признать, что в обеих холинэсте-разах в качестве основной группировки активного центра выступает имидазол гистидина, то трудно понять столь существенное различие в величинах теплот диссоциации. Во-вторых, даже если измерение активности фермента при разных pH рассматривать в качестве своеобразного титрования функциональных групп активного центра, то полученные результаты нельзя безапелляционно считать отражением прямого участия этих групп в каталитическом акте. Можно представить, что ионы Н и ОН -среды выполняют свою функцию, вызывая не только протонизацию или депротонизацию функциональных групп активного центра, но также и более общую функцию создания и поддержания специфической для каждого фермента третичной структуры. Можно думать, что в создании третичной структуры фермента большую роль играют ионные связи между такими группировками, которые расположены вне активного центра и непосредственно не участвуют в реакции с субстратом. Такие ионогенные группировки при взаимодействии могут сближать друг с другом (или наоборот удалять друг от друга) определенные функциональные группы белка, которые непосредственно участвуют в каталитическом акте. Внешне эта непрямая роль кислотно-основных группировок фермента будет отражаться в форме обычной зависимости кинетических констант (и, V, Кт) от pH, но по существу такая зависимость не дает оснований для решения вопроса, является ли она следствием влияния pH на конформацию белка в районе активного центра или диссоциацию группировки, прямо участвующей в реакции с субстратами. [c.184]

Методы измерения активности ферментов делят на две группы одни основаны на остановке реакции через определенные промежутки времени, в других прирост продукта или убыль субстрата регистрируются непрерывно. [c.208]

Механизмы и стадии ферментативного катализа. Единицы измерения активности ферментов. [c.95]

Измерение активности ферментов [c.279]

Эндоглюканазы. В большинстве случаев активность эндоглюканаз определяют по отношению к КМ-целлюлозе и выражают в относительных единицах, пригодных лишь для сравнения активностей ферментов в пределах одной лаборатории. Методы определения вискозиметрической активности в абсолютных международных единицах были разработаны ранее в работах [64, 65]. Это позволило стандартизовать измерения активностей ферментов. Однако общий недостаток данных методов связан со сложной математической обработкой протяженных участков кривой уменьшения вязкости реакционной смеси во времени. [c.136]

Таким образом, для определения бимолекулярной константы скорости необратимого взаимодействия фермента с ингибитором необходимо в стандартных условиях определить активность фермента (скорость ферментативной реакции) в отсутствие ингибитора (оо). Далее нужно к раствору фермента (в той же концентрации) прибавить ингибитор в концентрации [I]. Величина [I] может быть выбрана на основании предварительного определения концентрации ингибитора, при которой активность фермента подавляется полностью (при завершении реакции). При измерении берется в 20—100 раз ббльшая концентрация [I]. Для определения величин необходимо через различные промежутки времени прекратить (или существенно замедлить) взаимодействие фермента с ингибитором и определить остаточную активность фермента в тех же условиях, при которых была определена Vo. Расчет констант производится по уравнению (УП1.28). Основную трудность в этом методе представляет прекращение реакции фермента с ингибитором (в особенности неконкурентным) в нужный момент времени. Наиболее простой способ — проведение реакции ингибирования при достаточно высокой концентрации реагирующих веществ с последующим сильным разбавлением раствора перед введением в систему субстрата и измерением скорости ферментативной реакции. Например, если исходная концентрации фермента (и, соответственно, ингибитора) в 30—40 раз выше, чем необходимо для последующего измерения активности фермента, то разбавление системы в 30—40 раз приведет к снижению скорости взаимодействия фермента с ингибитором в 900—1200 раз. Тогда при достаточно быстром измерении начальной скорости каталитического превращения субстрата скоростью последующего ингибирования можно пренебречь. [c.116]

По полученному значению к+1 и на основании измерения активности фермента (и) при тех же условиях (pH, температура, состав среды и т. п.), при которых проводились эксперименты с ингибитором, можно рассчитать концентрацию фермента по уравнению Михаэлиса [c.124]

Количественные биохимические эксперименты, например измерение активности ферментов, имеют смысл, только если рост клеток можно тщательно контролировать. Полезно рассмотреть принципы этих методов, поскольку они применимы и для анализа клеток из амниотической жидкости. [c.14]

Точный диагноз типа гипераммониемии устанавливают путем определения метаболитов орнитинового цикла в крови или моче, а также путем измерения активности ферментов цикла в биоптате печени. Если гипераммониемия вызвана дефектом не карбамоилфосфатсинтетазы I, а любого другого из четырех [c.350]

Ферментативные дефекты. Наиболее прямым подходом к исследованию нарушений метаболизма служит поиск соединений, метаболизм которых осуществляется неправильно, и измерение активности ферментов, участвующих в его превращении. Именно таким способом были изу- [c.33]

В тех случаях, ког Да определить абсолютную концентрацию активных центров по каким-либо причинам не удается, ограничиваются измерением активности фермента, выражая ее как количество фермента, необходимое для превращения 1 мкмоля субстрата в 1 мин. Предложено большое число субстратов и способов, в ток. числе автоматических [1688], позволяющих, определить очень низкие концентрации амидгидролаз [1689-1714]. Некоторые из используемых для этой цели субстратов перечислены в табл.33. [c.148]

ИЗМЕРЕНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ [c.277]

В качестве маркеров применяют также ферменты. Основгшная на этом принципе специальная аппаратура для высокочувствительного ферментативного иммунохимического анализа выпускается серийно. В этом случае определяемый компонент метят ферментом. С антителами взаимодействуют как свободные, так и связанные с ферментом соединения, причем активность фермента при образовании комплексов АГ-АТ. как правило, подавляется (иногда усиливается). Концентрацию исследуемого вещества определяют путем измерения активности фермента по отношению к соответствующему субстрату. Чем больше концентрация немаркированного соединения, тем меньше фермента связьшается антителами и тем выше его активность. При этом достигается высокая чувствительность определений, характерная для ферментативных методов анализа. Использование ферментов-маркеров для контроля за ходом иммунохими- [c.299]

Другим примером миграции ацильной группы от N к О под влиянием безводного к-ислотного реагента Является обратимое инактивирование лизоцима безводной муравьиной кислотой прн комнатной температуре [167]. В этом случае ход перегруппировки контролировался путем определения содержания аминного азота и измерения активности фермента. Полное инактивирование наступало через 16 час. Помимо увеличения содержания аминного азота изменение белка выразилось также в появлении повышенного суммарного положительного заряда, что сказалось на подвижности молекулы белка при ионофорезе. В водной среде при pH 8,5 происходили Обратные изменения при pH 7,5 обращение было нет полным, если судить по ионофорезу и поглощению щелочи, [c.223]

Метод рН-стата был использован для определения холинэстеразы Гликом [39] в 1938 г. обзор возможности его применения дан в работе Якобсена и др. [48]. Достоинства этого метода — его точность и чувствительность. Особое преимущество данного метода состоит в том, что он позволяет вести реакцию при различном pH, включая и те области pH, которые лежат за пределами возможности бикарбонатного буфера (с помощью манометрического метода измерение можно производить только в области этого буфера). При этом методе исключается также нежелательное изменение pH, характерное для дельта-рН-метода. рН-Статный метод более пригоден, чем манометрический для измерения активности фермента при низких концентрациях субстрата, так как в этих условиях вследствие быстрого расщепления субстрата реакция заканчивается за 5 мин, а только с помощью рН-статного метода можно регистрировать процесс немедленно после добавления субстрата. Другое преимущество этого метода перед манометрическим или методом дельта-рН состоит в том, что здесь нет помех со стороны буферных веществ. Его недостатком является сравнительно медленное выполнение измерения, а также то, что он таит в себе все технические и аналитические трудности, связанные с техникой титрометрии. [c.435]

Ионселективные электроды можно приспособить для измерения активности ферментов и концентраций соединений, служащих субстратами для некоторых ферментов [15]. Например, кристаллический мембранный Hg2S/HgI-элeктpoд, предназначенный для прослеживания за иодид-ионом, можно использовать и для определения глюкозооксидазы и глюкозы, согласно уравнениям [c.186]

Общие проблемы выявления гетерозигот. Впервые важность выявления и изучения гетерозигот для медицинской генетики отметил в 1949 г. Нил [1236]. Им были систематизированы имевшиеся в то время разрозненные данные. Позже (в 1953 г.) появились более полные работы Нила [1237] и (в 1954 г.) Франческетти и Клайна [1084]. Быстрое развитие биохимической генетики сделало возможным выявление гетерозиготных носителей многих болезней, особенно тех, которые обусловлены дефектами ферментов, выявляемых в фибробластах или клетках крови (табл. 4.10). Как правило, активность ферментов у гетерозигот снижена приблизительно вдвое по сравнению с нормальными гомозиготами, однако во многих случаях четкую грань между этими двумя группами провести невозможно. Некоторые индивиды демонстрируют промежуточные характеристики даже при прямом измерении активности фермента. Это неудивительно, если принять во внимание, что разные мутации в составе одного и того же локуса вызывают изменения активности фермента различных типов. Выявление гетерозигот важно не только для изучения механизма действия ферментов, оно имеет очень большое практическое значение. Установление факта гетерозиготности очень существенно для людей, у которых близкие родственники страдают болезнями, детерминируемыми Х-хромосомой или аутосомно-рецессивными болезнями. Например, сыновья женщин, гетерозиготных по Х-сцепленному заболеванию, с вероятностью 50% наследуют эту болезнь. Для большинства аутосомно-рецессивных болезней выявление гетерозигот не играет столь важной роли, если только потенциальные гетерозиготы-братья или сестры больного гомозиготного индивида-не собираются жениться на двоюродных родственниках. Риск появления гомозиготных детей имеется только в том случае, когда будущие родители оба гетерозиготны, а для большинства рецессивных заболеваний вероятность случайной встречи таких гетерозигот чрезвычайно мала (см. закон Харди-Вайнберга, разд. 3.2). [c.54]

Индометацин и вольтарен относительно медленно взаимодействуют с активным центром РОН-синтетазы. Процесс установления равновесия занимает более 10 мин. Если в реакционную смесь для измерения активности фермента вводить равновесную реакционную смесь фермент — ингибитор, по детектируемой активности можно оттитровать находящийся в растворе свободный фермент. [c.10]

Чтобы измерить активность фермента, необходим метод определения количества образовавшегося продукта (или иногда количества израсходованного субстрата). Такой метод может включать стадию разделения субстратов и продуктов после реакции можно также измерять концентрацию одного из компонентов смеси независимо от присутствия другого. Удобно разделить способы измерения активности ферментов на две группы периодические (stopped) и непрерывные методы. Последние будут рассмотрены в следующем разделе. Непрерывные методы позволяют следить за ходом реакции во времени, не прерывая ее течения, что является большим преимуществом. Однако непрерывные методы имеют ряд ограничений, и для многих ферментов нет подходящих способов таких измерений. Периодиче- [c.286]

С помощью биосенсоров можно также измерять активность большого числа ферментов в крови. Измерение активности ферментов, связанных с сердечной деятельностью (таких, как аспартатаминотрансфераза, креатинкиназа, креатинкиназа МВ), позволяет оценить глубину инфаркта в клинических условиях. Наряду с определением концентрации лактата и глюкозы измерения активности этих ферментов в стационаре представляют определенную ценность при назначении терапевтического лечения больных с потенциально летальной аритмией в предгоспитальной фазе острого инфаркта миокарда. Стационарные измерения активности амилазы могут быть ценны в педиатрии. [c.16]

Пример 14-Б. Исследование химических реакций. В ходе реакции должно изменяться поглощение одного из реагентов. В качестве примера из энзимологии рассмотрим измерение активности фермента р-галактозидазы. Эта методика широко используется в молекулярной биологии при изучении функционирования лак-тозного оперона. Этот фермент расщепляет о-нитрофенилгалак-тозид (ОНФГ) с образованием о-нитробензола, который можно определить по его поглощению при 420 нм. Так как, по крайней [c.394]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология