Методы приготовления аффинного сорбента

Аффинная хроматография [27—31] представляет собой один из наиболее специфических методов выделения реакционноспособных соединений, в частности ферментов, и даже таких надмолекулярных агрегатов, как вирусы. Сорбентом в этом случае служит гель типа агарозы, к которому ковалентно присоединен подходящий лиганд, например субстрат фермента. Когда раствор, содержащий выделяемое вещество (скажем, фермент), пропускают через колонку с соответствующим образом приготовленным сорбентом, взаимодействие этого вещества с закрепленным на сорбенте лигандом (в данном случае фермента с субстратом) приводит к его удерживанию и, следовательно, к концентрированию. Поскольку сорбция носит обратимый характер, это вещество можно затем элюировать с колонки. Один из вариантов этого приема, который, строго говоря, уже не относится к области хроматографии, заключается в том, что иммобилизованный на геле фермент служит для непрерывного превращения растворенного в подвижной фазе субстрата. Разделение по методу аффинной хроматографии может быть основано на различного рода специфических взаимодействиях, таких, как связывание фермента с ингибитором, гормона с рецептором, антигена с антителом, а также гибридизация полинуклеотидов. Этот метод позволяет выделять даже целые клетки. [c.21]

Несмотря на объективные недостатки, метод аффинной хроматографии во многих случаях не имеет альтернативы в биохимическом анализе. С методиками приготовления аффинных сорбентов, техникой эксперимента и конкретными примерами практического применения метода можно познакомиться в специальных изданиях [89, 96]. [c.202]

Методы приготовления аффинного сорбента [c.181]

По вполне понятным причинам при поиске аффинных сорбентов внимание в первую очередь было обращено на субстрат рестриктаз — ДНК- В ряде случаев для очистки этих ферментов была использована колонка с однонитевой ДНК-агарозой, приготовленной смешиванием расплавленной горячей агарозы с денатурированной дезоксирибонуклеиновой кислотой тимуса теленка по методу Шеллера с сотр. [236]. Предполагалось [217], что с сорбентом преимущественно будут связываться неспецифические нуклеазы, а рестриктазы, субстратом которых является нативная ДНК, окажутся во фракции несорбировавшихся белков. Для некоторых рестриктаз это предположение, согласно утверждению Робертса [217], оправдалось и была получена хорошая их очистка. Наряду с этим было обнаружено, что некоторая часть исследованных специфических эндонуклеаз достаточно прочно связывалась с однонитевой иммобилизованной ДНК и элюировалась градиентом соли острыми пиками. В этом случае тоже наблюдалась значительная очистка этих ферментов от неспецифических нуклеаз. Хроматография на однонитевой ДНК, иммобилизованной на агарозе или целлюлозе, была применена на последней стадии очистки рестриктаз Hha I [174], Bsp I [152] и E oR I [184]. В качестве сорбента для очистки специфических эндонуклеаз нашла применение и нативная ДНК, иммобилизованная на полиакриламидном геле или целлюлозе, которые были использованы в случае Bsu I [58] и ВЬе I [c.155]

В основе принципа аффинной хроматографии лежит отличительная особенность биологически активных веществ образовывать стабильные, специфические и обратимые комплексы. Если иммобилизовать один из компонентов комплекса, то получится специфический сорбент для второго его компонента, при этом, разумеется, предполагается, что соблюдаются все условия, необ.ходимые для образования этого комплекса. Связывающие участки иммобилизованных веществ должны сохранять хорошую стерическую доступность для второго участника комплекса даже после связывания с нерастворимым носителем и не должны деформироваться. Примерами первых специфических сорбентов, приготовленных путем ковалентного связывания с нерастворимым носителем, были иммобилизованные антигены (Кемпбелл и др. [5]) . Методы, созданные для присоединения антигенов и антител к нерастворимым носителям, были сразу же применены для получения иммобилизованных ферментов. В то же время ранее предложенный азидный способ привязки ферментов к целлюлозе [25] стал использоваться для приготовления иммуносорбентов. Параллельное развитие обоих направлений, основанных на использовании связывания биологически активных веществ с нерастворимыми носителями, наглядно демонстрируют названия первых обзорных статей Реакционноспособные полимеры и их использование для приготовления смол с антителами и ферментами (Манеке [23]), Водонерастворимые производные ферментов, антигенов и антител (Сильман и Качальский [39]) и Химия и использование производных целлюлозы для изучения биологических систем (Великий и Витол [47]). Оба направления продолжали развиваться параллельно и после открытия других более эффективных носителей и разработки методов связывания, позволяющих сохранять свойства иммобилизуемых веществ в растворе. [c.11]

Степень замещения — важный показатель при хроматографии на окрашенных сорбентах. Это справедливо и для других методов аффинной хроматографии. Если в связывании участвует не одна, а большее число молекул красителя, то этим достигается более прочная адсорбция (см. рис. 4.40). Кроме того, чем выше значение mt, тем больше оказывается а [уравнение (4.5)]. Иногда бывает так, что высокозамещеннын гель связывает нужный фермент так прочно, что последующий его выход оказывается очень низким. Б таком случае следует использовать менее замещенные гели, уменьшая время обработки геля красителем в ходе приготовления адсорбента. Для получения устойчивых результатов следует фиксировать степень замещения [98]. [c.169]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология