Неспецифические нуклеазы

Электрофоретический метод отличается простотой выполнения и избирательностью. Это единственный из известных методов оценки активности рестриктаз, в результате применения которого имеется возможность судить о характере расщепления субстрата — каждая специфическая эндонуклеаза генерирует уникальный набор фрагментов ДНК субстрата, который после проведения электрофоретического их разделения дает определенный, характерный для этого фермента набор зон в геле. Рассмотрение таких картин позволяет судить не только о наличии рестриктазы в исследуемом растворе, но отчасти и об ее активности и субстратной специфичности. Последнее свойство обсуждаемого метода оказывается очень важным в тех случаях, когда в фракционируемой смеси содержится более чем одна рестриктаза. Кроме того, снижение интенсивности и четкости зон ДНК позволяет судить о наличии в фракциях неспецифических нуклеаз. Однако, электрофоретический метод наряду с отмеченными достоинствами имеет существенный недостаток, выражающийся в том, что количественное определение активности исследуемых ферментов проводится путем оценки перехода неполное расщепление—полное расщепление субстрата. Для того, чтобы идентифицировать этот переход, необходимо проводить обработку субстрата различными количествами фермента, что значительно увеличивает число анализируемых проб. Если учесть, что в ходе хроматографической очистки такой оценке подлежат многие десятки фракций, трудоемкость количественного определения активности рестриктаз электрофоретическим методом в таких опытах становится очевидной. Однако использование именно этого метода оправдывает себя в случае определения активности конечного препарата, предназначенного для применения в качестве аналитического реагента. В этом случае необходимо знать количество фермента, обеспечивающее исчерпывающее специфическое фрагментирование [c.127]

Большим достоинством обсуждаемого метода является возможность его использования для тестирования активности специфических эндонуклеаз, несмотря на присутствие некоторых количеств неспецифических эндонуклеаз. Эта особенность электрофоретического метода способствует быстрой проверке многих штаммов. Однако, в таких опытах наблюдаются и случаи относительно большого содержания неспецифических нуклеаз в бесклеточных экстрактах некоторых исследуемых культур, что может маскировать активность целевых ферментов и тем самым препятствовать их выявлению [179]. [c.136]

Очищенные препараты рестриктаз необходимы как для их характеристики, так и для использования в качестве аналитических реагентов в различных сферах применения этих ферментов. Выделение рестриктаз, как и любых других ферментов, преследует две цели — получение ферментных препаратов, свободных от нежелательных примесных активностей (функциональная чистота), или получение гомогенных белков (физическая чистота). В случае специфических эндонуклеаз в качестве нежелательных примесей в первую очередь выступают неспецифические нуклеазы и фосфатазы, имеющиеся во всех клетках, а иногда и рестриктазы, присутствующие наряду с целевым ферментом в биомассе некоторых продуцентов. [c.141]

Существует несколько объективных причин наблюдаемого явления. В первую очередь это связано с тем, что в начальных стадиях очистки наличие в исследуемых препаратах примесных неспецифических нуклеаз не позволяет, за редкими исключениями, проводить количественную оценку активности рестриктаз. Но даже в случае потенциальной возможности такой оценки, отсутствие простых методов для ее осуществления не способствует проведению обсуждаемого анализа. Количественная оценка примесных неспецифических нуклеаз (особенно эндонуклеаз) тоже встречается с методическими трудностями. [c.142]

Обсуждаемому способу удаления нуклеиновых кислот характерен ряд недостатков. Гельфильтрация практически применима при работе с небольшими количествами биомассы. Высокая ионная сила в этих опытах применяется с целью диссоциации комплекса нуклеиновых кислот и рестриктаз. Однако, в этих условиях диссоциируют и неспецифические нуклеазы, которые, учитывая специфику осуществления экспериментов по отделению нуклеиновых кислот методом гельфильтрации, ориентированных на грубое фракционирование, могут в значительной мере загрязнять целевые ферменты. О низком уровне очистки в таких опытах вообще говорилось выше. [c.149]

Неспецифическая нуклеаза расщепляет образовавшиеся фрагменты [c.208]

Методы, используемые для проверки исследуемых культур (см. разд. 2, часть II), не дают полной гарантии выявления специфических эндонуклеаз во всех штаммах, содержащих их. Одной из очевидных причин этому явлению в случае применения биохимического метода может быть маскирование рестриктазной активности неспецифическими нуклеазами. Именно неблагоприятное соотношение этих ферментов по мнению Майера и Райхенбаха [249 ] послужило причиной того, что среди 45 проверенных штаммов ytophaga только в двух случаях удалось выявить специфическое фрагментирование субстратов, проинкубированных с бесклеточными экстрактами исследуемых культур. Таким образом, применение традиционного метода тестирования наличия рестриктаз в исследуемых культурах дало в обсуждаемом случае исключительно низкую частоту встречаемости продуцентов. Для того, чтобы выяснить, насколько полученные данные отражают истину, необходимо применить другие методические подходы. [c.24]

Основным требованием при использовании рестриктаз в генно-инженерных и других молекулярно-генетических экспериментах является функциональная чистога, а именно, отсутствие примесей неспецифических нуклеаз и фосфатаз. Поэтому, основные усилия при выделении и очистке рестрикционных эндонуклеаз направлены на получение функционально чистых их препаратов. Однако, для структурно-кинетических исследований эндонуклеаз рестрикции требуются относительно больщие количества гомогенных препаратов ферментов. Несмотря на то, что как уже отмечалось, в настоящее время охарактеризовано (и в большинстве случаев выделено) более 1000 рестриктаз, лишь небольшая их часть получена в го(могенном состоянии. [c.66]

В случае использования биологических методов, как следует из приведенных выше примеров, огромное число штаммов исключается из круга исследуемых уже на первых стадиях проверки. Биохимической проверке доступны все штаммы. Однако, и в этом случае существует множество причин, по которым имеющиеся в клетках специфические эндонуклеазы могут быть не обнаружены. Вряд ли все их можно предусмотреть и перечислить. Среди Очевидных причин видимого отсутствия искомой активности (кроме упомянутого выше отсутствия сайтов узнавания в субстрате) в опытах in vitro можно перечислить следующие отсутствие сайтов узнавания может иммитироваться природными модификациями субстратов как в виде метилирования, так и более сложными ее вариантами [19, 155]. Предположительно часть рестриктаз может инактивироваться в ходе получения бесклеточных экстрактов или маскироваться присутствием большой, относительно рестриктазной, активностью неспецифических нуклеаз. Несмотря на исключительно высокую чувствительность электрофоретического метода [241],. из-за маскирующего действия нуклеаз она может только снизиться. Проявление последнего фактора особенно должно сказаться на обнаружении рестриктаз, содержащихся в клетках в незначительных количествах. Состав рестрикционных смесей,, используемых для определения активности рестриктаз в опытах по их поиску, может оказаться далеко не оптимальным. В ка- [c.140]

Наиболее широко в опытах по выделению рестриктаз применяется электрофоретический метод [241], использование которого позволяет идентифицировать фракции, содержащие основную массу целевого фермента, и визуально оценить наличие примесей неспецифических нуклеаз. Учитывая тот факт, что основным направлением препаративной биохимии рестриктаз является получение небольших количеств функционально очищенных их препаратов, применение качественного метода (электрофоретического) является вполне оправданным. Однако, [c.142]

В завершение обсуждения методических приемов, используемых для разделения нуклеиновых кислот и рестриктаз, хотелось бы обратить внимание на некоторые вопросы. Взаимодействие рестриктаз и нуклеаз — основных интересующих исследователя компонентов грубого экстракта, с нуклеиновыми-кислотами, вносит ощутимый вклад в результаты экспериментов. Использование высокой ионной силы позволяет исключить-этот фактор в случае гельфильтрации и высаждения нуклеиновых кислот при помощи ПЭИ. Однако в этих условиях в общем случае должен наблюдаться переход во фракцию, содержащую рестриктазы, неспецифических нуклеаз. Поэтому, если цель эксперимента сводится не просто к разделению нуклеиновых кислот и рестриктаз, а к определенной функциональной очистке целевого фермента, более привлекательным является использование таких приемов, которые позволяют варьировать ионную силу. Перспективным в этом отношении является применение катионитов. При взаимодействии грубых экстрактов с катионитами нуклеиновые кислоты в общем случае должны оказаться в несорбированной фракции. Проведение процесса в условиях низкой или умеренной ионной силы призвано обеспечить удаление вместе с нуклеиновыми кислотами и определенной части иеспецифических нуклеаз. Хотя это специально и не оговорено, данные об эффективной функциональной очистке более десяти рестриктаз по схеме, разработанной Грин с соавт. [109], прошедших, вслед за стадией фракционирования грубых экстрактов на ФРП, хроматографию на ГАП, косвенно подтверждает это предположение. [c.153]

По вполне понятным причинам при поиске аффинных сорбентов внимание в первую очередь было обращено на субстрат рестриктаз — ДНК- В ряде случаев для очистки этих ферментов была использована колонка с однонитевой ДНК-агарозой, приготовленной смешиванием расплавленной горячей агарозы с денатурированной дезоксирибонуклеиновой кислотой тимуса теленка по методу Шеллера с сотр. [236]. Предполагалось [217], что с сорбентом преимущественно будут связываться неспецифические нуклеазы, а рестриктазы, субстратом которых является нативная ДНК, окажутся во фракции несорбировавшихся белков. Для некоторых рестриктаз это предположение, согласно утверждению Робертса [217], оправдалось и была получена хорошая их очистка. Наряду с этим было обнаружено, что некоторая часть исследованных специфических эндонуклеаз достаточно прочно связывалась с однонитевой иммобилизованной ДНК и элюировалась градиентом соли острыми пиками. В этом случае тоже наблюдалась значительная очистка этих ферментов от неспецифических нуклеаз. Хроматография на однонитевой ДНК, иммобилизованной на агарозе или целлюлозе, была применена на последней стадии очистки рестриктаз Hha I [174], Bsp I [152] и E oR I [184]. В качестве сорбента для очистки специфических эндонуклеаз нашла применение и нативная ДНК, иммобилизованная на полиакриламидном геле или целлюлозе, которые были использованы в случае Bsu I [58] и ВЬе I [c.155]

В области препаративной биохимии рестриктаз практически, только в случае выделения гомогенных препаратов этих ферментов описание схем очистки сопровождается количественными данными, позволяющими оценить эффективность отдельных стадий и выход целевого продукта. Приложение усилий для получения таких сведений в определенной степени диктуется и необходимостью подбора эффективных стадий, обеспечивающих получение необходимых количеств гомогенных препаратов рестриктаз. Однако, при оценке схем их получения в целом следует отметить, что в связи с присутствием в бесклеточных экстрактах неспецифических нуклеаз количественное определение активности целевых ферментов во многих случаях оказалось возможным проводить только после частичной их очистки. Это исключает возможность оценки эффективности первых стадий и всей схемы в целом. Тем не менее наличие количественных данных последующих стадиях очистки является полезной информацией, позволяющей оценивать эффективность сорбентов. [c.163]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология