Иммуносорбенты, приготовление

В связи с интенсивным применением иммобилизованных ферментов в биотехнологии методы получения различных нерастворимых производных соединений белковой и небелковой природы хорошо разработаны. Многие из них могут быть эффективными и для получения-иммобилизованных препаратов антител и антигенов (иммуносорбентов). Чаще всего для целей твердофазного ИФА приготовление иммуносорбентов осуществляют либо ковалентным связыванием, либо адсорбцией вещества на поверхности носителя. [c.201]

Антитела для приготовления иммуносорбента [c.171]

Для приготовления иммуносорбента необходимо иметь очищенный антиген. Если речь идет о препаративном получении специфических антител, то без этого, очевидно, не обойтись. Однако при очистке относительно небольшого количества антител можно ограничиться разделением исходного клеточного экстракта, например методом электрофореза, и отделять специфические антитела из антисыворотки по их связыванию с зоной (полосой или пятном) антигена в геле. Удобнее для этой цели использовать не сам гель, а его реплику на диазобумаге [Остерман, 1981], где антигены фиксируются ковалентно. [c.112]

Приготовление иммуносорбента. Br N-активированную сефарозу (I г) обрабатывают, как обычно (с. 297). Полученный гель (3,5 мл) быстро промывают бикарбонатным буфером (pH 8,3) и вносят в раствор антител (20 мг антител в 10 мл бикарбонатного буфера). Инкубируют 2 ч при комнатной температуре, осторожно перемешивая механической мешалкой. Гель промывают в 100 мл того же буфера и переносят для блокирования оставшихся активных групп матрицы в 20 мл глицинового буфера 0,2 М, pH 8. Инкубируют 2 ч при комнатной температуре, постоянно осторожно перемешивая механической мешалкой. На воронке гель отмывают от несвязавшихся иммуноглобулинов и глицина бикарбонатным буфером (pH 8,3), затем ацетатным буфером, pH 4. Цикл повторяют, затем отмывают фосфатным буфером и хранят в нем при 4 С. [c.325]

В основе принципа аффинной хроматографии лежит отличительная особенность биологически активных веществ образовывать стабильные, специфические и обратимые комплексы. Если иммобилизовать один из компонентов комплекса, то получится специфический сорбент для второго его компонента, при этом, разумеется, предполагается, что соблюдаются все условия, необ.ходимые для образования этого комплекса. Связывающие участки иммобилизованных веществ должны сохранять хорошую стерическую доступность для второго участника комплекса даже после связывания с нерастворимым носителем и не должны деформироваться. Примерами первых специфических сорбентов, приготовленных путем ковалентного связывания с нерастворимым носителем, были иммобилизованные антигены (Кемпбелл и др. [5]) . Методы, созданные для присоединения антигенов и антител к нерастворимым носителям, были сразу же применены для получения иммобилизованных ферментов. В то же время ранее предложенный азидный способ привязки ферментов к целлюлозе [25] стал использоваться для приготовления иммуносорбентов. Параллельное развитие обоих направлений, основанных на использовании связывания биологически активных веществ с нерастворимыми носителями, наглядно демонстрируют названия первых обзорных статей Реакционноспособные полимеры и их использование для приготовления смол с антителами и ферментами (Манеке [23]), Водонерастворимые производные ферментов, антигенов и антител (Сильман и Качальский [39]) и Химия и использование производных целлюлозы для изучения биологических систем (Великий и Витол [47]). Оба направления продолжали развиваться параллельно и после открытия других более эффективных носителей и разработки методов связывания, позволяющих сохранять свойства иммобилизуемых веществ в растворе. [c.11]

Хилл [17] осуществил элюирование антител с иммуносорбентов с помощью смесей диоксана со слабыми органическими кислотами. Использование сшитой агарозы для приготовления иммобилизованного группового вещества крови А позволило Кристиансену [23] применить для элюирования хаотропные ионы, а именно роданид, трихлорацетат и трифторацетат. Эффективность хаотроп- [c.271]

Ответить на вопрос, какая концентрация антител, специфичных к данному антигену, находится в исследуемом образце, можно только на основе графика, откалиброванного по некоторому стандарту антител. При получении такого стандартного препарата возникает ряд сложностей. Во-первых, антитела необходимо выделять в высокоочищенном состоянии, чтобы иметь возможность охарактеризовать концентрацию препарата. Для этого используют метод иммуноадсорбцин, что, в свою очередь, определяется доступностью очищенного агента в количестве, необходимом для приготовления иммуносорбента. [c.261]

I. В пробирки е антителами, присоединенными к иммобилизованному на сефарозе СБА, вносят фракцию мембранных гликопротеидов, содержащую NP-40, Содержимое непрерывно перемешивают в течение 16 ч прн 4" С. Несвязавшийся материал отмывают 0,5%-ным раствором NP-40 в ЗФР, а затем —0,5%-иьтм раствором. ЧФ-40 в 0,5 М Na l, забуферениом фосфатами. Иммуносорбент переносят в небольшую колонку, сделанную из пластикового шприца с выходом, закрытым стеклянной ватой для удержания геля сефарозы. После этого гель промывают раствором NP-40, приготовленным па ЗФР, до тех пор пока радиоактивность промывной жидкости не снизится до уровня фона. Специфически связанные белки элюируют затем однилг [c.61]

В качестве источника желатины, получаемой из коллагена крупного рогатого скота, можно использовать пустые Желатиновые капсулы, расплавляя их в дистиллированной воде при 40— 60°С. Чистая желатина из других источников тоже пригодна для приготовления иммуносорбента, но не нашла широкого применения. Горячий раствор желатины в дистиллированной воде (20 г на 100 мл) стерилизуют фильтрацией через мембраны фирмы Millipore (размер пор 0,45 мкм) и хранят при 4°С. Концентрацию желатины в растворе можно определить по оптической плотности при 215 нм (коэффициент экстинкции i m =17,50). [c.281]

Для приготовления антигенных иммуносорбентов используют два способа. В первом из них достаточно концентрированный раствор антигена превращают в пространственную сетку, сшивая молекулы белка между собой глютаровым альдегидом или другим бифункциональным агентом. Второй способ состоит в ковалентном связывании антигена с гидрофильной водонерастворимой полимерной матрицей типа полиакриламида, агарозы или сефадекса. [c.110]

Приготовленный таким образом иммуносорбент переводят в 0,01 М фосфатный буфер (pH 7) с 0,15 М Na l, заполняют им небольшую колонку, на которую и наносят антисыворотку или иммуноглобулины, растворенные в том же буфере. Колонку хорошо промывают фосфатным буфером, но с удвоенной концентрацией соли, а иногда и с добавкой 1—2% неионного детергента Тритона Х-100 —все это для снятия неспецифически сорбированных белков. Элюировать антитела с колонки можно 0,1 М уксусной кислотой или 4,5 М раствором Mg b. Затем следуют завершающие операции нейтрализации, диализа и, если надо, концентрирования раствора очищенных антител. Колонку регенерируют, хорошо промывая посадочным буфером, и хранят на холоду с добавкой 0,1% азида натрия. [c.111]

При сравнительной оценке двух описанных вариантов приготовления иммуносорбента первый из них привлекает своей простотой и безопасностью, но следует иметь в виду, что глютаровый альдегид сшивает белки-антигены столь тесно, что взаимодействие с антителами происходит только на поверхности частиц раздробленного геля. У сефарозы и сефадекса такое взаимодей- [c.111]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология