Электрофорез в формирующемся градиенте

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ФОРМИРУЮЩЕМСЯ ГРАДИЕНТЕ pH [c.53]

Анализ субъединиц глютенина с помощью электрофореза при кислых pH или двумерного электрофореза ДДС-ПААГ-ИЭФ или ДДС-ПААГ в формирующемся градиенте pH обнаруживает значительные различия их зарядов. Каждую полосу, наблюдаемую при одномерном электрофорезе и соответствующую определенной молекулярной массе, можно посредством электрофокусирования разделить на большое число белков, отличающихся своими изоэлектрическими точками. Так, по Данно и др. [57], субъединицы с предполагаемой молекулярной массой в пределах [c.208]

Окончательное формирование градиента pH и фокусирование белков в этом градиенте требуют много времени, так как при подходе к равновесному положению амфолиты и белки утрачивают заряд и движутся очень медленно. Между тем, сортировка амфолитов по значениям р1 и образование градиента pH в основном (как бы вчерне ) происходит быстро. Если вносить белки в гель с одного его конца, например анодного, то уже в самом начале образования градиента pH этот конец закисляет-ся в достаточной степени, чтобы все белки смеси приобрели положительный заряд и начали мигрировать вдоль поля. Заряды белков зависят от их собственных значений р1, поэтому начальные скорости миграции разных белков смеси могут существенно отличаться друг от друга. По мере продвижения вдоль формирующегося градиента pH белки постепенно утрачивают заряд и замедляются, но тоже не одинаково. Раньше всего это произойдет с менее заряженными белками, в данном случае кислыми. Щелочные белки, для которых положение равновесия находится где-то на другом конце градиента pH, будут двигаться быстро почти вдоль всего геля. Происходит разделение белков не в стационарном состоянии фокусирования, а еще до него —в динамическом режиме электрофореза в формирующемся градиенте pH. Фракционирование идет по заряду, но с расширенными возможностями, обусловленными изменением pH вдоль геля. Процесс этот требует не больше времени, чем обычный электрофорез при неизменном pH. Момент его окончания выбирается экспериментатором от равновесного состояния он может быть еще очень далек. Собственно говоря, дело сводится к тому, что явление фокусирования белков используют не до конца, но в такой мере, что уже реализуется его преимущество в разрешающей способности по сравнению с электрофорезом. Единственное, чем приходится пожертвовать по сравнению с истинным ИЭФ — это возможностью определения р1 белков. [c.53]

Как уже упоминалось, в результате такого фракционирования получается сложная картина, насчитывающая иной раз более тысячи пятен. Она проявляется обычными методами — окрашиванием красителем СВВ R-250 или (в случае радиоактивных белков) авторадио- и флюорографией. После этого возникает нелегкая задача идентификации каждого пятна и сопоставления расположения пятен в различных опытах с учетом неизбежных отличий, вытекающих из невозможности абсолютно точного воспроизведения условий разделения, особенно при электрофорезе в формирующемся градиенте pH. Для решения этой задачи необходимо ввести какие-то системы отсчета, более надежные, чем простое измерение координат пятен. [c.56]

Фирма LKB рекомендует примешивать к исходному белковому препарату в качестве спейсеров амфолины. Отличие от ИЭФ здесь в том, что амфолины вносят не в объем геля или жидкости, в которых проводят электрофорез, а только в исходный препарат, причем в таком количестве, которого недостаточно для обеспечения проводимости по всему объему фракционирования. В отличие от ИЭФ, в этом случае зоны расположения амфолинов не перекрываются и сами они не разряжаются, не формируют градиента pH, а мигрируют в качестве ионов наряду с белками, встраиваясь между ними в цепочку зон с убывающей электрофоретической подвижностью. Все амфолины в этой системе несут заряд одного знака, но в зависимости от своих р1 различаются по величине этого заряда, образуя тем самым широкий набор спейсеров с различными электрофоретическими подвижностями. При этом pH среды, в которой идет миграция, определяет буферный противоион. [c.77]

Стабилизация разделяемых компонентов при работе в периодическом режиме достигается при помощи градиента некоего вещества (сахарозы, фиколла и др.), которое соприкасается с электролитом, находящимся в электродных сосудах (рис. 3.8). Градиент плотности формируют над слоем концентрированного раствора вещества, используемого для создания градиента. Этот слой выполняет роль своего рода прокладки. Охлаждение осуществляется и снаружи (водяная рубашка), и изнутри (охлаждающий цилиндр) циркулирующей водой, температура которой составляет 4°С. Таким образом, поперечное сечение колонки имеет форму кольца, охлаждаемого с обеих сторон. По окончании электрофореза фракции отбирают, выпуская содержимое колонки через отверстие в ее нижней части или высасывая его при помощи насоса через капиллярную трубку в центре охлаждающего цилиндра [87]. [c.117]

Этот прием был использован О Фарреллом н соавторами вместо ИЭФ для разделения белков в первом направлении при двумерном фракционировании [О РаггеИ е1 а1., 1977] он был назван электрофорезом в формирующемся градиенте pH [c.53]

Картина разделения сложной смеси кислых и щелочных белков в первом направлении при использовании амфолинов диапазона pH 3,5—10 получается не очень хорошей. Кислые белки, как было отмечено, успевают сфокусироваться, но это происходит на коротком отрезке кислого участка градиента pH. Щелочные же белки начинают заметно различаться по своей электрофоретической подвижности и соответственно фракционироваться только во второй половине своего пути через гель. Такого рода фракционирование полезно для первоначального обзора всего набора белков. Далее исходную смесь следует в одном эксперименте разделить методом ИЭФ, как описано О Фарреллом, а в другом — подвергнуть электрофорезу в формирующемся градиенте pH с амфолннами для диапазона pH 7—10 или смесью амфолинов для диапазонов pH 6—8 и 8—10 (по 1% каждого). [c.54]

Для электрофореза гистонов в формирующемся градиенте pH первого направления авторы отдают предпочтение амфоли-нам диапазона pH 6—8. Хорошо заряженные гистоны мигрируют быстро, и все фракционирование заканчивается за 2 ч. На 20 мкл исходного препарата в трубке диаметром 2,4 мм из-за наличия в нем 0,2% ДДС-Na наслаивали 10 мкл 8 М раствора мочевины, содержащего 5% NP-40, 0,8% амфолинов pH 5—7 и 0,2% амфолинов pH 3,5—10. На пластине второго направления одновременно с гистонами было выявлено около 130 белков основного характера. [c.55]

Во втором направлении белки разделяли ступенчатым электрофорезом в пластине ПААГ размером 13X14 см и толщиной 0,8 мм. В качестве рабочего геля до уровня на 2,5 см ниже верхнего края пластины полимеризовали экспоненциальный градиент (5—22,5%) ПААГ в 0,375 М Трис-НС1 (pH 8,8) с добавлением 0,1% ДДС-Na, стабилизированный глицерином. Формирующий гель представлял собой 4,75%-ный ПААГ, полимеризованный в 0,125 М Трис-НС1 (pH 6,8) с 0,1% ДДС-Na. Клиновидную полость над пластиной для помещения в нее цилиндри-, ка геля первого направления формировали так, как это принято делать при двумерном электрофорезе [Остерман, 1981]. Эту полость заполняли расплавленным 1%-ным раствором агарозы в том же буфере, а затем закладывали в нее цилиндрик геля. В качестве верхнего электродного буфера использовали, как обычно при электрофорезе по Лэммли, раствор, содержащий 0,025 М Трис, 0,192 М глицин и 0,1 % ДДС-Na (pH 8,3) с добавлением бромфенолового синего в качестве лидирующего красителя. Электрофорез длился 5 ч при силе тока 20 мА. За это время полоса красителя достигала нижнего края пластины. Для окрашивания белков после электрофореза использовали 0,1%-ный раствор СВВ R-250 в 50%-ной ТХУ. Перед авторадиографией гель высушивали и экспонировали с рентгеновской пленкой от суток до месяца в зависимости от исходной радиоактивности препарата и необходимости выявления слабых пятен. Прн этом следует иметь в виду, что при увеличении продолжительности экспозиции увеличивается и размер каждого пятна — примерно вдвое при 10-кратном удлинении экспозиции. Соответственно может ухудшаться разрешение близко лежащих пятен. [c.47]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология