Формирующий гель

В том случае, когда растворимые силикаты смешиваются с растворами солей металлов (кроме щелочных), осаждаются нерастворимые аморфные силикаты таких металлов. Однако характер получаемого осадка даже при одних и тех же начальных условиях может в значительной степени изменяться в зависимости от интенсивности перемешивания при данной температуре смеси и от того, какой компонент присутствует в избытке. Механизм формирования осадка в отсутствие перемешивания особенно заметен в процессе развития так называемого химического сада , когда кристаллы солей металлов опускаются в относительно концентрированный раствор силиката натрия. Как только соль металла растворяется, тотчас же между двумя растворами образуется мембрана, состоящая из аморфного силиката металла. Так как ионы водорода и гидроксил-ионы быстро диффундируют, то со стороны силиката формируется гель кремнезема, а со стороны соли металла — гидроксид металла. Однако в том случае, когда оба раствора совместно попадают в зону интенсивного действия силы сдвига, получаемой за счет энергичного перемешивания смеси, в осадок будет [c.223]

Описанный выше традиционный процесс осветления сока статичен — подразумевается, что шапка всплывает на поверхность сама по себе. В настоящее время на некоторых французских заводах применяют динамический процесс осветления. После начального процесса деметилирования с добавлением фермента в течение 2-х дней сок отпрессовывают с добавлением азота и хлорида кальция и перекачивают в танк для непрерывной флотации. Формирующийся гель из пектата кальция поднимается на поверхность танка с помощью пузырьков азота. Шапка непрерывно снимается с поверхности сока особым скрепером, и под ней остается прозрачный сок, который затем перекачивают в другой бродильный чан. [c.97]

Каждому варианту свойственны собственные преимущества и недостатки. Общие принципы и методика эксперимента электрофореза в ПААГ подробно рассмотрены в ряде исчерпывающих публикаций [3, 35, 73, 183]. В ступенчатой системе образцы предварительно концентрируются в формирующем геле, после чего входят в рабочий гель в виде узких зон. В непрерывной системе предварительное концентрирование исключено и при нанесении образца в большом объеме по завершении электрофореза образуются широкие зоны. Если образец наносить в небольшом объеме, результаты в обеих системах должны быть идентичны. Наблюдающиеся иногда различия в результатах, возможно, обусловлены частичной диссоциацией комплекса при электрофорезе в ступенчатой системе. [c.27]

Концентрация акриламида в рабочем геле 5%—25%, в формирующем геле (длиной 20 мм) 4,5%. [c.30]

После кратковременного нагревания до кипения образцы вносят в лунки с помощью микрошприца или микропипетки. Электрофорез проводят при 100 В до прохождения красителем формирующего геля, затем при 200 В до подхода зоны красителя к нижнему краю геля. Продолжительность электрофореза зависит от длины геля и геометрии камеры, обычно электрофорез длится 3 ч. [c.31]

Буфер формирующего геля 0,5 трис, оттитрованный фосфорной кислотой до pH 6,8. [c.44]

После прибавления к р твор деаэрируют под вакуумом водоструйного насоса и переносят в камеру для электрофореза (защищают от кислорода воздуха слоем воды или насыщенного водой изобутанола). По заверщении полимеризации сливают защитный слой, поверхность промывают раствором формирующего геля и вносят пред- [c.44]

Образцы вносят с помощью микрошприца или микропипетки. Электрофорез проводят при 100 В до прохождения зоной красителя формирующего геля, а затем при 200 В до приближения зоны красителя к нижней границе геля. [c.45]

На стыке гелей ПААГ и агарозы в силу заметного различия степени эндосмоса может иметь место смазывание линий иммунопреципитации и искажение ее картины, поэтому используют специальный метод наложения полосы ПААГ на гель агарозы. Последний формируют из двух частей. У края пластины, который впоследствии будет обращен к катоду, заливают слой геля агарозы без антисыворотки с таким расчетом, чтобы он был на несколько миллиметров шире, чем полоса ПААГ, которую предстоит уложить на этот слой вровень с наружным его краем. Вплотную к пустому слою агарозы на остальной площади пластины слоем такой же толщины формируют гель агарозы в смеси с антисывороткой. Линия раздела двух слоев должна быть параллельна катодному краю пластины и ориентированной по нему полосе ПААГ. Переносить и накладывать эту последнюю на гель агарозы удобно с помощью упомянутой выше тонкой металлической пластинки. Перед наложением пластинку следует повернуть полосой геля к себе, а затем перевернуть гелем вниз и таким образом уложить его на поверхность агарозы. Электродные фитили накладывают на наружный край полосы ПААГ (катодный) и на противоположный край пластины геля агарозы. В ходе электрофореза во втором направлении антигены из ПААГ переходят в гель агарозы и далее мигрируют в ней, образуя пики преципитации. Различие степени эндосмоса в этом случае никаких проблем не создает. [c.151]

Теперь рассмотрим процессы, протекающие в этой системе, после включения электрического напряжения. В первый момент напряженность поля будет примерно одинаковой во всех ступенях системы и начнется переход белков из буфера препарата в формирующий гель. В это же время в верхней части формирующего геля начнет развиваться новая ситуация. Под действием поля ионы С1" будут быстро уходить в направлении рабочего геля, а на их место из электродного буфера будут поступать ионы глицина. Но здесь они окажутся в буфере с pH 6,8. При этом, как следует из изложенного, большинство молекул глицина восстановит заряд своих аминогрупп, нейтрализуется и перестанет участвовать в проведении тока. Сопротивление буфера препарата, а за ним и верхней части формирующего геля резко возрастет. Вместе с ним возрастет и напряженность поля. Не- [c.68]

Мы видели,, что в верхней части формирующего геля возникает область повышенной напряженности поля, в которой оказываются и успевшие перейти в гель белки. Естественно, что они мигрируют в ней относительно быстро. Так же быстро идет переход белков из буфера препарата в формирующий гель. Впрочем, белки мигрируют все же медленнее, чем ионы глицина, так как отношение заряда к массе у белков меньше. Описанные явления постепенно распространяются на весь формирующий гель. Ионы хлора, отступая, очищают весь объем этого геля. Вплотную за ними к границе с рабочим гелем подходит глицин. Теперь весь формирующий гель находится в зоне повышенной напряженности поля. В этом поле ускоренно движутся белки, уже перешедшие из исходного раствора препарата в формирующий гель. Никакого их концентрирования пока не происходит оно начнется лишь тогда, когда впереди идущие молекулы белка достигнут границы рабочего геля. Тем временем линия раздела ионов хлора и глицина уйдет уже в рабочий гель, где замена одних ионов на другие не вызовет увеличения напряженности поля. Дело в том, что здесь молекулы глицина оказываются при pH 8,9, который обеспечивается степенью ионизации и высокой концентрацией Триса. При этом pH большая часть нейтральных молекул глицина снова превращается в ионы. Эти нейтральные молекулы оказались в рабочем геле в силу статистического характера миграции глицина, который был описан выше. Электропроводность Трис-глицинового буфера в верхней части рабочего геля оказывается столь же высокой, как и Трис-НС1 (этого добились подбором pH 8,9 и концентрации всех компонентов системы). Напряженность электрического поля в рабочем геле соответственно остается низкой, и это обстоятельство играет решающую роль в концентрировании белков. [c.69]

Впереди идущие молекулы белков достигают границы раздела и переходят в. рабочий гель, где попадают в область низ-, кой напряженности поля. Скорость их миграции резко падает. Между тем следующие за ними молекулы белка еще движутся в объеме формирующего геля, т. е. в области высокой напряженности поля, и движутся быстро. Потом и они входят в рабочий гель и почти останавливаются. Это происходит со всеми моле- [c.69]

Аналогичную картину ступенчатого электрофореза легко представить себе и для кислого буфера рабочего геля, В качестве слабой ( буферной ) кислоты можно использовать уксусную, а роль быстро мигрирующего иона поручить К" ". В качестве цвиттериона, поставляющего медленно мигрирующие ионы, берут р-аланин. Подбор количественного соответствия концентраций и pH дает следующую пропись для построения системы. Для получения буфера рабочего геля 4,3%-ный водный раствор уксусной кислоты титруют КОН до pH 4,3. Буфер формирующего геля готовят аналогичным титрованием 0,35%-ного раствора уксусной кислоты до pH 5,8. Буфер верхнего электрода (анода) получают из 0, )35 М водного раствора р-аланина, титруя его до pH 4,5 опять-таки уксусной кислотой. Напомним (и это следует не упускать из виду, особенно для лабильных белков), что pH буфера рабочего геля во время фракционирования в нем белков оказывается несколько иным, чем первоначальный (примерно на 0,5 выше в случае использования щелочного буфера и настолько же ниже —для кислого). [c.70]

Как было предложено Шоупом (см. лит. к гл. 2 [97, 96]), очень прочные покрытия могут, вероятно, приготовляться за счет использования жидкой смеси, способной формировать гель, состоящий из силиката калия, коллоидного кремнезема и схватывающего агента. [c.506]

Патрик и Мак-Гавак [209] исследовали силикагели с точки зрения их важного практического применения в качестве адсорбентов. Прочно связанные силикагели, которые можно было нагревать до красного каления без разрушения или потери адсорбционной способности, производились посредством смешивания довольно крепких растворов, содержащих силикат натрия с отношением 5102 Ыа20 3,3 1 и избыточное количество соляной кислоты, что позволяло формировать гель, который затем промывали и медленно высушивали. За период с 1920 по 1950 г., как указывал в своей монографии Вайл [199], было разработано большое число способов подкисления и гелеобразования растворов, получаемых из растворимых силикатов, повышения механической прочности силикагелей, снижения усадки и увеличения их пористости. Процесс медленного высушивания является сушественным для предотвращения раздробления кусочков геля, возникающего из-за более сильной усадки наружных слоев в таком материале. Высокая концентрация кремнезема (вплоть до 15 г на 100 мл) в застудневающих растворах дает возможность получать плотные и механически прочные силикагели. Волф и Бейер [210] в своем обзоре рассмотрели взаимосвязь между условиями приготовления силикагеля из кислоты и силиката и свойствами конечного продукта. Основное положение заключается в том, что при промывании горячей водой увеличивается размер первичных частиц и понижается удельная поверхность. Выдерживание при pH >7 приводит к аналогичному эффекту. Если вода в гидрогеле замещается органической жидкостью, имеющей более низкое поверхностное натяжение, то формируемый силикагель будет давать меньшую усадку при высушивании, сохраняя большие по размеру поры. [c.700]

Оккерс и де Бур [236] выполнили более тщательное исследование на основе их прежних, давно полученных результатов. Они подтвердили, что значение pH влияет главным образом на размер частиц, который устанавливается еще до того, как начинает формироваться гель. Концентрация кремнезема — лишь вторичный фактор, поскольку после того, как гель испытывает усадку в процессе высушивания, удельная поверхность и размер пор силикагеля определяются размером первичных частиц, плотность упаковки которых приблизительно одна и та же независимо от концентрации. Согласно их наблюдениям (см. рис. 5.17), размер частиц быстро возрастал в области pH 4—8, что подтверждается заметным спадом величины удельной поверхности, начиная от 800 м /г (при диаметре частиц 3—4 нм) и до 200 м /г (при диаметре 14 нм). Когда размер частиц составляет меньше 5 нм, то силы, вызывающие усадку и действующие в процессе высушивания в порах очень малого диаметра, могут спрессовывать такие частицы в произвольную, плотную упаковку (5102 занимает 60 % от объема, т. е. пористость равна 0,3 см г). [c.711]

Буфер формирующего геля имеет следующий состав 0,5 М трис + 0,4% (масс./об.) ДСН, pH 6,8 (подтитрован с помощью НС1). [c.30]

Раствор деаэрируют дважды — перед добавлением ДСН и (вюрпчио) перед прибавлением персульфата и ТЕМЕД. После внесения в систему иа поверх1юсть раствора осторожно наслаивают воду или насыщенный водой изобутанол. По завершении полимеризации всрхннй слой отсасывают, промывают поверхность геля буфером формирующего геля и наслаивают раствор для приготовления формирующего геля. Для приготовления 10 мл этого раствора (концентрация 4,5%) смешивают 1,5 мл запасного буфера, 2,5 мл буфера формирующего геля, 6,0 мя воды, 10 мг персульфата аммония, 10 мкл ТЕМЕД. [c.31]

Буфер для приготовления образцов 2 мл буфера формирующего геля, 6 г мочевины, 5 мл воды, 5 мг бромофенолового синего. [c.44]

Двумерный электрофорез. Проводят электрофорез в первом направлении при рП 8,9 (или ином pH) в присутствии 8 М мочевины, а затем во втором направлении в присутствии ДСН. С целью сужения зон иа границе геля электрофорез во втором направлении проводят в ступенчатой буферной системе. Гель из трубки помещают па слой формирующего геля в торец пластины и фиксируют с помощью агарозы (ко1щентрация ДСН и буфере для образца 17о (масс./об.), см. разд. 1.3Л) [115]. Электрофорез во втором направлении можно вести в непрерывной буферной системе на градие1ггиом геле, тогда сужение зон будет идти вблизи стационарного положения. В этом случае гель из трубки (диаметр 3,5 мм) уравновешивают в течение 30 мин с 100 ил электродного буфера (0,025 М фосфат, pH 7 + + 0,15% ДСН) и помещают на верхний торец готовой (фирменной) пластины градиентного геля (4—27%) (разд. 1.3.1.1), которую предварительно пропитывают ДСН с помощью электрофореза при 50 мА в течение 3 ч. Разделение проводят при 30 мА в течение 15 мин и 50 мА в течение 3,5 ч [114]. [c.45]

Во втором направлении белки разделяли ступенчатым электрофорезом в пластине ПААГ размером 13X14 см и толщиной 0,8 мм. В качестве рабочего геля до уровня на 2,5 см ниже верхнего края пластины полимеризовали экспоненциальный градиент (5—22,5%) ПААГ в 0,375 М Трис-НС1 (pH 8,8) с добавлением 0,1% ДДС-Na, стабилизированный глицерином. Формирующий гель представлял собой 4,75%-ный ПААГ, полимеризованный в 0,125 М Трис-НС1 (pH 6,8) с 0,1% ДДС-Na. Клиновидную полость над пластиной для помещения в нее цилиндри-, ка геля первого направления формировали так, как это принято делать при двумерном электрофорезе [Остерман, 1981]. Эту полость заполняли расплавленным 1%-ным раствором агарозы в том же буфере, а затем закладывали в нее цилиндрик геля. В качестве верхнего электродного буфера использовали, как обычно при электрофорезе по Лэммли, раствор, содержащий 0,025 М Трис, 0,192 М глицин и 0,1 % ДДС-Na (pH 8,3) с добавлением бромфенолового синего в качестве лидирующего красителя. Электрофорез длился 5 ч при силе тока 20 мА. За это время полоса красителя достигала нижнего края пластины. Для окрашивания белков после электрофореза использовали 0,1%-ный раствор СВВ R-250 в 50%-ной ТХУ. Перед авторадиографией гель высушивали и экспонировали с рентгеновской пленкой от суток до месяца в зависимости от исходной радиоактивности препарата и необходимости выявления слабых пятен. Прн этом следует иметь в виду, что при увеличении продолжительности экспозиции увеличивается и размер каждого пятна — примерно вдвое при 10-кратном удлинении экспозиции. Соответственно может ухудшаться разрешение близко лежащих пятен. [c.47]

В одной из стеклянных пластинок формы для геля второго направления делали вырез, подобно тому как это предусмотре- но в приборе Стадиера для электрофореза в вертикальных пластинах [Остерман, 1981]. Верхний электродный резервуар иа плексигласа (который при ИЭФ не должен быть- объемистым) имел точно такой же вырез в передней стенке. Этот резервуар через резиновые прокладки зажимами крепили прямо на пластинки геля, совмещая вырезы. При полимеризации верхнего, формирующего геля на поверхность раствора в вырез пластинки укладывали стеклянную палочку диаметром 3 мм (при толщине геля 0,8 мм). Таким образом, на торце геля после полимеризации образовывался желобок. В него с листа парафильма скатывали длинный и тонкий цилиндрик геля, расправляли его. и заливали расплавленным 1%-ным раствором агарозы. Плас-тину геля до уровня верхнего резервуара погружали в 20-литровый аквариум, заполненный нижним электролитом. Электрофо-рез вели в течение 10 ч при силе тока 50 мА. После фракциони- рования 20 мкг белка из клеток тимуса крысы с исходной С-радиоактивностью 5 10 имп./мин авторадиография при двухнедельной экспозиции выявляла 1750 пятен. В том же объ- екте при использовании гелей обычного размера обнаруживаются только 500 пятен. [c.49]

Уравновешенную таким образом полоску геля первого направления на той же полиэтиленовой пленке переносят в форму, где уже полимернзован гель второго направления. Одна из двух стеклянных пластинок формы сделана более длинной, чем другая. К выступающей сверху ее части прижимают пленку с гелем, а затем осторожно шпателем сдвигают полоску с пленки и вводят ее между пластинками формы, постепенно и равномерно прижимая к торцу формирующего геля второгр направления. Этот торец должен быть обсушен фильтровальной бумагой, иначе белки смогут выходить из полоски геля и смешиваться, диффундируя вдоль слоя жидкости между полоской и гелем. После установки полоски ее фиксируют заливкой расплавленной агарозой. [c.50]

Этот принцип проще всего понять, отталкиваясь от проведенного в предыдущей книге подробного рассмотрения процессов ступенчатого электрофореза [Остерман, 1981]. Вспомним поведение используемых там двух сильно отличающихся по электрофоретической подвижности анионов — хлора и глицина. Хлор в ходе электрофореза отходит к аноду, и вслед за ним из катодного резервуара движется отрицательно заряженный при щелочном pH ион глицина. Значение pH задается Трис-буфе-ром. В любой ситуации, при любом pH ион глицина следует вплотную за ионом хлора. В формирующем геле при pH 6,8, когда электрофоретическая подвижность глицина мала, происходит перераспределение напряженности электрического поля таким образом, чтобы обеспечить миграцию ионов глицина с такой же скоростью, как и ионов хлора. Разрыва между ними быть не может — иначе бы не было тока. Перераспределение напряженности поля вдоль столбика геля при ступенчатом электрофорезе используется длй сужения исходной полосы сме- си белков. Существенно, что концентрация белков при этом настолько мала, что вклад их собственной ионной проводимости незначителен по сравнению с электропроводностью буфера. Белки мигрируют в электрическом поле, не зависящем от их присутствия. Ион глицина обгоняет самый быстрый из белков, и собственно фракционирование белковой смеси происходит в Трис-глициновом бу( ре с pH 8,8 — в поле неизменной напряженности. [c.75]

Для заливки и полимеризации геля нижние торцы трубок заклеивают парафильмом или лейкопластырем и устанавливают их строго вертикально в штатив. Деаэрированный раствор мономеров сразу после добавления и надежного смешивания с ним раствора персульфата аммония заливают по стенке трубки из пипетки с полиэтиленовым наконечником так, чтобы верхний участок трубки, предназначенный для внесения препарата, оставался сухим. Затем осторожно по стенке наслаивают воду или изобутанол и ведут полимеризацию, как описано в предыдущем разделе. Если готовят гель для ступенчатого электрофореза (см. ниже), то после окончания полимеризации нижнего (рабочего) геля воду стряхивают, споласкивают поверхности буфером верхнего (формирующего) геля и точно так же заливают слой раствора мономеров верхнего геля, а затем наслаивают на него воду или изобутанол. Перед установкой готовой трубки с гелем в прибор парафильм снимают, а ее свободный конец промывают верхним электродным буфером. [c.23]

Недавно Спайкер описал систему фракционирования гистонов в двуступенчатом ПААГ с кислой мочевиной . Основной рабочий гель — пластина (толщиной 0,5 мм) 15%-го ПААГ в 0,9 М СНзСООН с 2,5 М мочевины. Над ним полимеризована полоска формирующего геля 7,5% ПААГ в 0,375 М СНзСООК, pH 4, с 2,5 М мочевины. Электрофорез при повышенном напряжении — за 1—2 ч. Качество полос и их разрешение в такой системе сильно выигрывают [5р1кег, 1980]. [c.55]

В формирующем геле небольшой протяженности (1—3 см) фракционирования белков не происходит. Наоборот, назначение этого геля — собрать смесь всех белков перед переходом в рабочий гель в одну узкую полосу, толщина которой может составлять сотые доли миллиметра независимо от первоначального объема препарата. Для рабочего геля она является исходной зоной для фракционирования, а это резко повышает его разрешающую способность. Поскольку в формирующем геле белки разделяться не должны, его концентрацию стараются сделать минимальной (7 =2,5- 3). Формирующий гель полимеризуют обычно в таком же по составу буфере, что и рабочий гель (следовательно, он тоже содержит быстроподвижный ион), однако по концентрации и значению pH эти буферы не одинаковы. Буфер формирующего геля, как правило, почти нейтральный, буфер рабочего геля— щелочной или кислый. Смысл этого различия будет раскрыт ниже. [c.66]

Важную роль в ступенчатом электрофорезе играет выбор электродного буфера, находящегося в контакте с белковым препаратом и формирующим гелем ( верхнего буфера в случае использования системы с вертикальным расположением геля). В этом буфере пддвижность иона, мигрирующего в том же на- [c.66]

Крупнопористый формирующий гель полимеризуют в 0,0625 М Трис-НС1, pH 6,8. В таком же буфере вносят> и препа-)ат (с добавкой, как обычно, до 10% глицерина или сахарозы), первоначально электропроводность этого буфера будет тоже высокой благодаря ионам С1". Их концентрация при pH 6,8 достаточно высока (см. выше). [c.67]

Авторы одной из работ [Hearing et al., 1976] растворяли белки до концентрации 1 мг/мл в течение нескольких часов в 1%-ном растворе Тритона Х-100. Затем этот раствор смешивали с равным объемом 20%-ной сахарозы в верхнем электродном буфере удвоенной концентрации и в таком виде наносили на формирующий гель в трубке. Тритон Х-100, связавшись с белком, может мигрировать вместе с ним, сохраняя растворимость белка, однако разделение полос оказывается более надежным, если 0,1% Тритона Х-100 вводят в гель. Правда, при фиксировании белков ТХУ Тритон Х-100 дает опалесцирующий фон, который приходится дольше отмывать. [c.83]

Иммобилизация путем вьслючения в гели состоит в том, что молекулы фермента вьслючаются в трехмерную сетку, образованную тесно переплетающимися нитями (цепями), формирующими гель. Пространство между полимерными цепями в геле заполнено водой, на долю которой приходится обычно значительная часть общего объема геля. Для иммобилизации фермента в геле существует два основных способа [c.86]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология