Локализация ферментов после электрофореза

Для изучения четвертичной структуры НАД-киназы из скелетных мышц кролика использовали препараты фермента, очищенные в 150—300 раз. Тремя независимыми методами электрофорезом в однородном геле и в градиенте концентрации полиакриламидного геля, путем разделения в тонком слое сефадекса С-200, с помощью гель-фильтрации через колонку с сефадексом С-200 — была обнаружена большая гетерогенность препарата в отношении НАД-киназы [2, 4]. Локализацию фермента в геле определяли по измерению активности в элюатах, полученных после разрезания столбика геля на диски толщиной 2 мм. При это оказалось, что по данным диск-электрофореза в однородном геле ферментативной активностью обладают четыре зоны, характеризующиеся значениями Rf 0,1, 0,52, 0,73 и 0,98. Повторный электрофорез белка с электрофоретической подвижностью, близкой к 1,0, после его элюции и кондентрирования обнаружил несколько белков с более низким, чем у исходного, значением Rf (0,73, 0,52, 0,07). [c.137]

Локализация ферментов после электрофореза [c.101]

После отключения тока в конце электрофореза диффузия разделенных молекул продолжается, поэтому локализацию ферментов нужно проводить как можно быстрее. [c.279]

Метод включения в гель субстрата или затравки. При использовании высокомолекулярного субстрата или затравки инкубация геля в растворе субстрата дает лишь весьма посредственные результаты, поскольку субстрат плохо проникает в гель и реакция происходит только на его поверхности. Проблема может быть решена путем включения субстрата в гель перед проведением электрофореза. В этом случае гели после электрофореза инкубируют в буферном растворе с подходящим значением pH или во влажной камере, а затем проводят окрашивание макромолекулярного субстрата. После обесцвечивания гелей в местах локализации фермента выявляются бесцветные или менее интенсивно окрашенные полосы. При использовании техники включения субстрата в гель должны выполняться два [c.280]

Эстеразы, гликозидазы, фосфатазы и пептидазы легко можно обнаружить после электрофореза с помощью реакции азосочетания. В качестве субстратов используют соответствующие производные а- или р-нафтола освободившийся под действием фермента нафтол вступает в реакцию сопряжения с солью диазония с образованием окрашенного соединения в зоне локализации фермента. Для выявления указанных выше ферментов применяют как метод одновременного сочетания, так и метод сочетания после инкубации. Однако первый метод дает, как правило, более четкие результаты. Хотя с точки зрения реакции азосочетания производные р-нафтолов имеют преимущества, скорость их ферментативного расщепления меньше, чем у а-нафтолов. Чаще всего в реакции азосочетания используют такие стабильные соли диазония, как прочный синий В или КК, прочный гранатовый ОВС и прочный черный К. [c.295]

Один весьма успешный способ преодоления этой трудности заключается в отделении нужного фермента от других белков с помощью гель-электрофореза [100]. Образец фермента наносят на довольно крупнопористый гель и электрофорез продолжают до тех пор, пока фермент четко не отделится от всех сопутствующих примесей. После локализации положения фермента в геле последний разрезают и слой, содержащий фермент, растирают до получения тонкой суспензии, состоящей из полиакриламидного геля и фермента. Эту суспензию и используют затем для первой инъекции нескольких сотен микрограммов белка оказывается вполне достаточно. Иммуноглобулины, полученные таким способом, содержат до 10% антител к нужному ферменту. Остальные 90% — это относительно неспецифические иммуноглобулины, присутствующие в организме животного к моменту иммунизации. К 1 см агарозы можно присоединить десятки миллиграммов иммуноглобулина, [101]. При этом на 1 смз геля будет приходиться до 1 мг специфических антител. Но, поскольку молекулы антител присоединяются к адсорбенту таким образом, что это приводит в большинстве случаев к потере их способности связывать антиген, концентрация активных антител будет составлять, вероятно, лишь около 0,1 мг/см Если каждая молекула этих антител связывает одну молекулу антигена с близким значением молекулярной массы, то емкость такой колонки будет порядка 0,1 мг/см , это небольшая, но вполне достаточная емкость для очистки малых [c.174]

Очень большое число ферментов было определено после электрофореза на различных носителях. В настоящей главе приведен ряд методов локализации некоторых ферментов in situ. [c.283]

Во многих методиках вспомогательные ферменты просто добавляют к инкубационной среде. Можно также использовать индикаторный гель , содержащий вспомогательный фермент (или ферменты). Еще один способ применения вспомогательного фермента описал Харрисон [518]. Для обнаружения после электрофореза в полиакриламидном геле гексокиназы, глюкозо- фосфатизомеразы и фосфоглюкомутазы к гелеобразующему раствору перед полимеризацией акриламида добавляют глюкозо-б-фосфат— дегидрогеназу. В результате вспомогательный фермент оказывается равномерно распределенным в геле и иммобилизованным благодаря возникновению ковалентных связей с матриксом. При этом он сохраняет способность катализировать превращение глюкозо-6-фосфата, образующегося под действием указанных выше ферментов. Таким образом, при инкубации геля в среде, содержащей NADP, ФМС и соль тетразолия, в местах локализации разделенных ферментов появляется формазан. [c.286]

Выше указывалось, что для локализации ферментов по их активности электрофорез желательно проводить в условиях, исключающих возможность денатурации. Однако в недавней работе [La ks, Springhorn, 1980] было показано, что очистку целого ряда ферментов (ДНКазы I, некоторых протеаз, амилазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы) можно производить электрофорезом в ПААГ с ДДС-Na после соответствующей обработки их детергентом при повышенной температуре. Денатурация оказывается обратимой. По окончании электрофореза ДДС-Na отмывают и одновременно снимают с белка встряхиванием геля в течение 1—2 ч в 0,04 М Трис-буфере, pH 7,6. Ферментативная активность в ряде случаев восстанавливается. [c.103]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология