Включение в субстрат

Метод включения в гель субстрата или затравки. При использовании высокомолекулярного субстрата или затравки инкубация геля в растворе субстрата дает лишь весьма посредственные результаты, поскольку субстрат плохо проникает в гель и реакция происходит только на его поверхности. Проблема может быть решена путем включения субстрата в гель перед проведением электрофореза. В этом случае гели после электрофореза инкубируют в буферном растворе с подходящим значением pH или во влажной камере, а затем проводят окрашивание макромолекулярного субстрата. После обесцвечивания гелей в местах локализации фермента выявляются бесцветные или менее интенсивно окрашенные полосы. При использовании техники включения субстрата в гель должны выполняться два [c.280]

Описаны приемы локализации протеолитической активности после электрофореза в крахмальном [655, 1120] и полиакриламидном гелях [57] с использованием методики включения субстрата в гель. Возможность применения этой методики для указанной цели была недавно изучена [37]. Чтобы предотвратить миграцию белкового субстрата вовремя электрофореза, эти авторы использовали в качестве субстрата казеин, осажденный кислотой. Нерастворимый казеин обрабатывали ультразвуком и образовавшиеся мельчайшие частицы смешивали с гелеобразующим раствором. Конечная концентрация казеина в геле составляла 0,1% (масса/объем). После электрофореза гель инкубировали в течение 2—12 ч при 37°С в 0,1 М буфере трис-НС1 (pH 7,5). Казеин пригоден только при электрофорезе в кислой среде, поскольку в щелочной среде он мигрирует. В этом случае вместо казеина можно использовать препарат гемоглобина, приготовленный путем осаждения и обработки ультразвуком. Окрашивание гелей белковым красителем (напри-, мер, нигрозином) увеличивало контрастность полос. [c.303]

Возможно включение линейных двух- и трехатомных субстратов, таких, как СО, N0, О2 или N3- Ионы металла находятся внутри макроциклического лиганда, причем каждый из них связан с несколькими донорными группами N 2, а также с расположенным в центре макроцикла субстратом (4 молекулы в случае Поскольку некоторые металлопротеины используют двухъядерные металлические центры для осуществления каталитической функции, то данная модель имитирует медные пары третьего типа в медьсодержащих ферментах. В двухъядерном Си (II)-комплексе расстояние Си—Си оценивается в 0,52 нм. Интересно, что этот комплекс обнаруживает антиферромагнетизм и является диамагнитным при комнатной температуре. [c.380]

На стадии ацилирования происходит нуклеофильная атака карбонильного углерода субстрата обобщенным нуклеофилом активного центра 8ег-195... Н1з-57... Азр-102. В результате ацилирования активного центра происходит поворот остатка 8ег-195 вокруг С —Ср-связей, что сопровождается перемещением атома кислорода на- 2,5А. При этом имидазольная группа Н1з-57 перемещается в сторону растворителя [18]. В результате имидазольная группа Н13-57, будучи включенной в свободном ферменте (и, по-видимому, в комплексе Михаэлиса) в водородную связь с 8ег-195 (рис. 31), в ацилферменте предоставляет свой М атом для образования водородной связи с водой (рис. 32). В итоге активированная молекула воды приобретает способность эффективно атаковать карбонильный- углерод субстрата на стадии деацилирования. При этом образуется кислотный продукт гидролиза и регенерируется свободный фермент. Таков в общих чертах химический механизм гидролитического действия химотрипсина. [c.131]

Бимолекулярный (синхронный, 2) механизм предполагает включение в стадию, ответственную за скорость процесса, двух молекул (субстрата и реагента) — ш = к [7 ЯаЛ[ВН1 [c.77]

Координационно-комплексный катализ осуществляется в тех случаях, когда кислоты и основания Льюиса, выступающие в роли катализаторов, образуют с одним из реагентов донорно-акцепторный комплекс, зачастую довольно стабильный. В ходе реакции и субстрат, и реагент оказываются включенными в координационную сс ру катализатора, исходное состояние которого восстанавливается после образования конечного продукта. [c.243]

Делая попытку спуститься от молекулярного уровня рассуждений к атомному субстрату и в особенности в свете положения атома в Системе, мы должны быть, по-видимому, осторожны и в смысле квантовомеханического углубления в понимание первопричин на основе уравнения Шредингера без включения в него временной зависимости. [c.351]

Отмытые и подсушенные с помош,ью кусочка фильтрова льной бумаги электроды полярографа осторожно опускают в кювету, заполненную 2 мл среды 1 (проба 1) до полного выхода пузырька воздуха. С помощью специального потенциометра устанавливают перо включенного самописца в исходное положение, соответствующее исходной концентрации кислорода в среде (в самописцах типа КСП-4 — в крайнее правое положение). Включают движение диаграммной ленты и, убедившись в отсутствии дрейфа, с помощью микропипетки добавляют в кювету 0,04—0,05 мл густой суспензии митохондрий (4—6 мг белка). В течение 40—60 с регистрируют медленное эндогенное дыхание и добавляют 0,02 мл сукцината (10 мМ), который вызывает небольшую стимуляцию дыхания. Через 40—60 с в кювету вносят раствор СаСЬ ( 100 мкМ). При этом дыхание сначала резко активируется, затем быстро снижается до исходного уровня. Добавку повторяют несколько раз до тех пор, пока стимуляция дыхания после каждого добавления сменяется четко выраженным торможением. Учитывая количество добавленного СаСЬ, оценивают его максимальную концентрацию, вызывающую обратимую стимуляцию дыхания. Для препарата интактных прочно сопряженных митохондрий (4—6 мг белка в кювете) эта концентрация обычно составляет 400—500 мкМ. В пробе 2 убеждаются в том, что выбранная концентрация СаСЬ вызывает обратимую стимуляцию дыхания с отчетливым выходом в контролируемое состояние. Для определения величины АДФ/О записывают следующую пробу. С этой целью в кювету со средой последовательно добавляют митохондрии, сукцинат и АДФ в концентрации от 300 до 400 мкМ (определение АДФ/О см. на с. 462). Проводят три аналогичных измерения с использованием в качестве субстрата окисления смесь глутамат—малат (по 5 мМ). В этом случае целесообразно уменьшить концентрацию добавляемого СаСЬ в 1,5—2 раза, а в среду инкубации предварительно добавить (непосредственно в кювету) 1 мМ НАД+ для предотвращения утечки эндогенных пиридиннуклеотидов. [c.452]

Включение одного из атомов Oj в молекулу окисляемого в-ва, др атом О восстанавливается с образованием HjO в результате окисления второго субстрата [c.125]

При иммобилизации ферментов необходимо, чтобы активные группы матрицы ие блокировали каталитич, центр фермента, а условия иммобилизации ие приводили к потере его активности. Определенные ограничения иа способ иммобилизации налагают и особенности субстрата. Так, в случае высокомол. субстратов нельзя использовать методы инкапсулирования или включения фермента в гель, Еслн матрица несет иа себе заряды, то заряд субстрата влияет на кинетич. параметры р-ции разноименные заряды иа носителе и субстрате увеличивают скорость р-ции, катализируемой И. ф,, одноименные заряды ее снижают в м. б. причиной полной потери активности препарата. Заряды носителя и субстрата влияют также иа величину pH, при к-рой скорость ферментативной р-ции максимальна. [c.215]

Разработан метод включения ферментов внутрь полых волокон триацетатцеллюлозы в момент их формования. Фермент оказывается включенным во внутр. полость, куда могуг проникать только низкомол. субстраты. Эти нити накручивают в ввде катушек, заключают в стеклянную оболочку и через такой бобинный ферментный реактор пропускают анализируемую смесь, напр., при определении пенициллина, мочевины или глюкозы. [c.79]

Иммобилизация ферментов в гелях обеспечивает равномерное распределение энзима в объеме носителя. Большинство гелевых матриц обладает высокой механической, химической, тепловой и биологической стойкостью и обеспечивает возможность многократного использования фермента, включенного в его структуру. Однако метод непригоден для иммобилизации ферментов, действующих на водонерастворимые субстраты. [c.89]

Второй подход к изучению обсуждаемой проблемы заключается в использовании 0-бикарбоната и регистрации включения 0 в карбокси-лированный субстрат. Если первичным субстратом служит СО2, то в [c.173]

Другой класс флавопротеидов, обсуждаемых в гл. 10 (разд. Ж, 2), составляют монооксигеназы или гидроксилазы. В этих ферментах восстановленный флавин способствует включению одного атома кислорода из молекулы О2 в субстрат с одновременным превращением другого атома кислорода в Н2О. Формально реакцию можно представить как расщепление связи между двумя кислородами аддукта в схеме (8-59) с образованием 0Н+ из концевой ОН-группы. [c.268]

Поскольку цитрат представляет собой симметричное соединение, считалось, что при включении в цитрат изотопа он всегда будет представлен в равном количестве в обеих концевых карбоксильных группах. Тогда должен обязательно включаться и в сукцинат. Лишь в 1948 г. Огстон сформулировал представление о том, что при связывании субстрата не менее чем в трех точках ферменты становятся способными к асимметричной атаке симметричных субстратов . Другими словами, фермент может синтезировать цитрат таким образом, что атомы углерода, поступающие от молекулы ацетил-СоА, будут попадать всегда только в одну из СНзСООН-групп, окружающих прохиральный центр (гл. 6, разд. Г,2). [c.323]

Реакции могут протекать в поверхностных слоях графита, и роль внедренной кислоты состоит в создании (регулировании) положительного заряда на его углеродных сетках. Если молекулы субстрата внедряются в незаполненное межплоскостное пространство графита, то реакция будет протекать без непосредственного контакта молекул субстрата с молекулами внедренных кислот, и направление реакции определяется в основном пространственными затруднениями, создаваемыми углеродными слоями графита. При локализации процесса в заполненном кислотами межплоскостном пространстве графита на процесс влияет природа кислоты-катализатора и вышеуказанные пространственные затруднения. Каталитическими центрами могут быть и внедренные кислоты, расположенные по краям кристаллов графита. В этом случае роль пространственных затруднений, создаваемых сеткой графита, должна быть незначительной. Самый неспецифический путь каталитического действия заключается в вымывании внедренных веществ в раствор и протекании реакции вне графита. Другими словами, слоистые соединения графита являются внутренними дозаторами катализатора. С точки зрения возбуждения реакций полимеризации мономера предпочтительны умеренные температуры процесса (-20°С), усиливающие влияние и природы внедренной кислоты, и параметров пространственной сетки графита. На это указывают зависимости эффективности катализатора от природы кислоты Льюиса и неактивность индивидуально взятых графита или кислоты [154, 155]. Низкие, как правило, скорости превращений определяют недостаточную технологичность катализаторов - соединений включения в графит, хотя у них есть и очевидные достоинства стабильность на воздухе, устойчивость к гидролизу, селективность в некоторых процессах. [c.60]

Прежде всего об общих принципах эксперимента. Меченый предшественник должен более или менее свободно входить в систему и становиться метаболически эквивалентным эндогенному субстрату, в который требуется ввести метку. Эти требования в общем соблюдаются, например, для ацетат-иона, в меньшей степени—для малонат-иона и часто совершенно не соблюдаются для введенного мевалонат-иона. Конечно, во время эксперимента организм должен продуцировать требуемое соединение из эндогенного субстрата (а не, например, из некоторого накапливаемого позднее промежуточного вещества). Эксперимент должен также обеспечивать возможность отличать проверяемый прямой путь включения от любых других неожиданных и часто в высшей степени косвенных путей. Например, структуры многих поликетидов таковы, что меченый поликетид в результате простых реакций расщепления может стать источником специфически меченного аце-тил-КоА, который затем может включаться в совершенно иное соединение. Еще один пример такие совершенно различные по структуре аминокислоты, как глицин, серии и триптофан, могут являться эффективными предшественниками С-метильных групп количественное сравнение с меченым метионином показывает, что последний представляет собой гораздо лучший предшественник, но результаты с другими аминокислотами могут быть правильно интерпретированы только при наличии определенных данных о промежуточном метаболизме. Соблюдение соответствующих биологических принципов может также оказаться выгодным при выборе наиболее экономичной или наиболее чувствительной методики. Как будет показано ниже, различные применяющиеся в настоящее время изотопы следует вводить в различных количествах этот факт следует учитывать, например, при проведении предварительных опытов с целью оптимизации условий включения предшественника. Кинетика включения предшественника может быть чрезвычайно сложной. Эта тема достаточно хорошо осЕ-г-щена в обзорах [1,96,97] описано и применение математического анализа кинетических данных, который имеет, по-видимому, ограниченное применение, но тем не менее важен как инструмент фундаментального исследования [98,99]. [c.467]

Крамер [63], Гогтшалк [116] и др. [150, 153, 167, 184], рассматривая способ действия фермента, предположили включение субстрата молекулой фермента. Крамер обращает внимание на циклодекстрины как на соединения, пригодные для разделения изомеров посредством включения. Эти наблюдения приводят к новому подходу к старой теории ферментов типа замок-ключ . [c.145]

Для лоХализации амилазы был также использован метод включения субстрата в гель перед полимеризацией акриламида к нему добавляли растворимый крахмал [406, 1465]. После электрофореза гели инкубировали 5 мин при 37°С в 0,1 М ацетатном буфере (pH 6,0) и окрашивали 0,1%-ным раствором иода в иодистом калии, содержавшим 1 н. уксусную кислоту. В тех местах, где находилась такаамилаза, появлялись бесцветные полосы на фиолетовом фоне [1465]. [c.298]

По всей вероятности, для методики включения субстрата в гель пригодны белки, окрашенные ремазоловыл/ярким синим, так как эти производные белков нерастворимь и были с успехом использованы в качестве субстрата при /Определении про-теазной активности [923]. / [c.304]

Простейшие ферментативные реакции, рассмотренные в 2.1 и 2.2, являются односубстратными. Однако многие ферментативные реакции для получения конечного продукта требуют нескольких субстратов. В связи с этим в 2.3 даны основы кинетики многосубстратных реакций. Показано, что существуют два основных механизма многосубстратных реакций механизм образования тройного комплекса и пинг-понг-механизм, отличающихся наличием или отсутствием необратимой стадии между этапами включения субстрата в реакции. Рассмотрены методы дискриминации этих механизмов. [c.332]

Все реакции микробиологического превращения углеводородов являются окислительными процессами. Предельная восстановлен-ность этих веществ делает необходимым для их окисления включение кислорода. Гидрофобный характер молекулы углеводородов является причиной того, что процессы окисления осуществляются оксигеназа-ми, в отличие от окисления более гидрофильных веществ, происходящего под действием дегидрогеназ. Гидрофобность углеводородных субстратов и их ничтожная растворимость в воде требует специфического способа транспорта таких веществ в клетку. Этот процесс еще недостаточно изучен, но имеющиеся в настояищй момент данные говорят о том, что на основном этапе он происходит пассивно, поэтому способы поступления углеводородного субстрата к клеткам в водной среде и его транспорта через оболочку существенно влияют на кинетику роста культур на углеводородных средах [149]. [c.85]

Оксигеназы катализируют включение в субстрат кислорода из молекулярного кислорода. Монооксигеназы включают один атом молекулярного кислорода в субстрат другой атом при этом высвобождается в виде Н2О2 или Н2О. Диоксигеназы вводят в субстрат оба атома кислорода. [c.399]

Присутствие второго нуклеофила или дополнительная э ектрофиль-ная (Е1) активация субстрата могут, в принципе, повлиять на распределение электронной плотности в переходном комплексе так, что энергия его образования окажется более низкой. Однако включение в переходный комплекс дополнительной частицы должно приводить к неблагоприятному изменению энтропии при его образовании. Суммарное изменение свободной энергии активации, определяющей скорость реакции, будет таким образом зависеть от относительной величины изменения ДЯ+ИТД 5. Этот вопрос был подробно исследован Брюсом и Бенковичем [50] на примере реакций замещенных фенилацетатов с гидразином и имидазолом. [c.95]

Рис. 24. Включение молекул п-замещенного (а) и м-замещенного (б) фенилацетатов в циклоамилозу, приводящее к вынужденному сближению 2-ОН группы амилозы и сложноэфирной группы субстрата в случае б

Мономолекулярный (асинхронный, карбониево-ионнып, 1) механизм предполагает включение в стадию, лимитирующую скорость реакции, одной молекулы (субстрата) w = k [R Hal], Образующийся карбкатион стабилизируется либо выбросом протона из амюложения к вакантной орбитали (Е ), либо захватом нуклеофила (5л 1) [c.76]

Показано, что региоспецифичное пара-замещение можно осуществить путем размещения молекулы субстрата в полости так, что только пара-положение выступает из нее. Хлорировав ние анизола проводили в растворах, содержащих циклодекстрин (циклогексаамилозу) — молекулу, которая почти полностью заключает в себя анизол (аналогично образованию соединений включения, обсуждавшемуся в т. 1, разд. 3.3). При достаточно высокой концентрации циклодекстрина соотношение пара- и орго-продуктов достигает 21,6 [50] (в отсутствие циклодекстрина это соотношение равно 1,48). Эта реакция может служить моделью региоселективности, обнаруживаемой при действии ферментов. [c.320]

Наиболее часто в отношенли механизма Сннна высказывается сомнение относительно участия ионных нар а реакШ1ЯХ метильных и первичных субстратой. В качестве компромисса Снин употребляет такие неопределенные выражения, как частица, похожая на карбокатион , включенная в ионную пару, й описывает ее как имеющую растянутую ковалентную связь. - [c.177]

При гомогенном Г. активация водорода и субстрата происходит путем их включения в координац. сферу каталитич. комплекса. При этом идет гетеролитич. или гомолитич. диссоциация водорода, что и создает условия для Г. Связь субстрата с атомом металла катализатора должна быть достаточно лабильной. Алкены, образующие слишком прочные связи, не гидрируются в этих условиях. В кач-ве катализаторов используют соед. переходных металлов соли, карбонилы, фосфиновые комплексы, двухкомпонентные системы, получаемые взаимод. солей с восстановителями или комплексообразователями (напр., катализаторы Циглера-Натты). Вследствие большей активности катализаторов и соотв. более мягких условий гомог. Г. обычно более избирательно, чем гетерогенное. Важная область применения таких процессов-синтез оптически активных в-в, напр. Г. а-фенилакриловой к-ты, катализируемое комплексами КЬС1з с фосфинами и проводимое в смеси бензол-этанол. [c.554]

Среди К. в. условно различают агенты прямого и непрямого действия. К первым относят высокореакционные соед. (этиленоксид и его производные, азотистые иприты и др.), способные непосредственно реагировать с биополимерами (ДНК, РНК, белки). Непрямые К. в. сами по себе инертны и превращаются в активные соед. при участии ферментов клетки-напр, монооксигеназ, катализирующих включение одного атома кислорода в молекулу субстрата. В результате образуются в-ва, к-рые реагируют с биополимерами. Так, метаболич. активация непрямого К. в. N-нитрозодиметил-амина (НДМЛ), вызывающего опухоли у мн. видов животных, осуществляется по схеме [c.306]

Подклассы О. (их 17) сформированы по типу окисляемого в-ва (восстановителя), подподклассы - по типу окислителя (акцептора восстановит, эквивалента). О. всех подподклас-сов, для к-рых акцептором служит ве О2, а любое др. соед., наз. дегидрогеназами, шш редуктазами, если акцептор О2-оксидазами. В тех случаях, когда атом О включается в состав субстрата, ферменты наз. оксигеназами (при включении в молекулу одного атома О монооксиге-назами, двух атомов О-диоксигеназами), если атом О включается в виде гр) ОН-гидроксила-зами. [c.353]

Иммобилизация ферментов в полупроницаемые структуры. Сущность этого способа иммобилизации заключается в отделении водного раствора фермента от водного раствора субстрата с помощью полупроницаемой мембраны, пропускающей низкомолекулярные молекулы субстратов и кофакторов, но задерживающей большие молекулы фермента. Разработано несколько модификаций этого метода, из которых интерес представляет микрокапсу-лирование и включение ферментов в липосомы. [c.89]

Находящийся в клетке ингибитор связывается с конформером А и при достаточно высокой концентрации переводит весь фермент в неактивную форму А. Фермент оказывается выключенным или по крайней мере обладает очень низкой активностью. Прн высоких же концентрациях активатора фермент будет включен за счет стабилизации конформации В. Доля молекул фермента, находящихся в активной форме В, определяется концентрацией ингибитора, активатора и субстрата в клетке в данный момент времени. Подобное соотношение между ингибированием и активацией лежит в основе многих явлени11 регуляции клеточного метаболизма (гл. 1, разд. Е). [c.36]

Для активации инертного окислителя - молекулярного кислорода - используют комплексы Си и Ре . Включение Оз в координационную сферу этих металлов приводит к реакции внутрисферного переноса одного или двух электронов и серии последующих окислительно-восстановительных процессов. Рассмотрим некоторые из этих реакций с участием 2,2 -дипиридильного комплекса ЬзСи , катализирующего окисление различных субстратов типа АНз (малоновая и аскорбиновая кислоты) [c.547]

Обычно активные центры ферментов включают части всех структурных доменов глобулярного белка. Активные центры всех известных мультидоменных белков (табл. 5.2) расположены между доменами (рис. 4.1). Эти домены определяются не только как глобулярные области, разделенные полостью активного центра, но имеют и другое характерное для доменов свойство — они связаны между собой только одной пептидной цепью (табл. 5.2). Субстраты и кофакторы обычно присоединяются к разным доменам. В случае NAD связывающий кофактор домен всегда имеет ту же самую с довольно развитой открытой поверхностью топологию н NAD присоединяется в эквивалентных положениях (рис. 5.17, б), что является результатом эволюции [254, 255]. Кроме того, этот домен обнаружен на N-конце трех дегидрогеназ и одной киназы [230— 233, 235], а также на С-концевой половине четвертой дегидрогеназы [234] и в средней части фосфорилазы [236], что указывает на возможность дупликации соответствующего гена и его переноса в другое место генома. Все эти факты, включение в активный центр частей различных доменов, наличие кофакторепецифичных доменов и возможность переноса домена дают основание предположить, что ферменты конструируются с использованием модульной системы кофактор и субстратспецифичные домены, необходимые для обеспечения заданной функции, отбираются и объединяются в одной цепи глобулярного белка [124, 256]. [c.117]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология