Макромолекулярные субстраты

Отличительная черта этого способа иммобилизации состоит в том, что ограничение свободы перемещения фермента в объеме системы достигается не за счет его взаимодействия с жестким носителем (адсорбентом, гелем или мембраной), а вследствие его способности растворяться только в одной из фаз двухфазной системы. Что касается субстрата и продукта ферментативной реакции, то они распределены между обеими фазами в соответствии с их растворимостями в этих фазах. Природа фаз подбирается таким образом, что продукт накапливается в той из них, где фермент отсутствует. После завершения реакции эту фазу отделяют и извлекают из нее продукт, а фазу, содержащую фермент, вновь используют для проведения очередного цикла процесса. Одним из важнейших преимуществ систем двухфазного типа является то, что они позволяют осуществлять ферментативные превращения макромолекулярных субстратов, которые невозможны при применении жестких носителей с ограниченным размером пор. [c.72]

Метод включения в гель субстрата или затравки. При использовании высокомолекулярного субстрата или затравки инкубация геля в растворе субстрата дает лишь весьма посредственные результаты, поскольку субстрат плохо проникает в гель и реакция происходит только на его поверхности. Проблема может быть решена путем включения субстрата в гель перед проведением электрофореза. В этом случае гели после электрофореза инкубируют в буферном растворе с подходящим значением pH или во влажной камере, а затем проводят окрашивание макромолекулярного субстрата. После обесцвечивания гелей в местах локализации фермента выявляются бесцветные или менее интенсивно окрашенные полосы. При использовании техники включения субстрата в гель должны выполняться два [c.280]

Как указывалось выше, некоторые микроорганизмы способны использовать в качестве питательных субстратов самые различные высокомолекулярные соединения полисахариды, белки, нуклеиновые кислоты, липиды и др. Однако макромолекулы не могут проникать через мембрану клетки. Они подвергаются расщеплению, которое осуществляется под воздействием экзоферментов> относящихся к классу гидролаз. Большинство из них катализирует гидролиз полимера до растворимых продуктов, обычно димеров или мономеров, которые поступают в клетку с помощью специфических транспортных механизмов. Образование экзоферментов широко распространено среди различных групп микроорганизмов. При поиске продуцентов ферментов-гидролаз в лабораторной практике применяют специальные методы. Сущность их состоит в следующем. Микроорганизмы выращивают на агаризованной среде, содержащей макромолекулярный субстрат. Если клетки выделяют в среду экзоферменты, гидролизующие данное соединение, то выросшие колонии окружены зоной, в которой обнаруживаются продукты гидролиза. [c.165]

Хотя макромолекулярные субстраты известны для многих ферментов, при выборе ферментной метки мы отдали предпочтение -галактозидазе. Этот фермент из Е. соИ имеется в продаже, он устойчив, отличается большим числом оборотов при расщеплении хромогенных субстратов удобных для анализа, его можно легко и без потери активности соединять с белками. Кроме того, в сыворотке человека не обнаружены ферменты, обладающие аналогичной активностью при тех же pH, что и -галактозидаза, и способные помешать анализу. [c.104]

Как хромогенные, так и флуорогенные макромолекулярные субстраты представляют собой катионные полимеры с большим положительным зарядом. Когда антителам сообщают большой отрицательный заряд, между ними и высокомолекулярным субстратом возникает притяжение. Кулоновские силы преодолевают стерические препятствия. Анализ с любым субстратом можно построить на ингибировании или на активации в зависимости от заряда антител. [c.113]

Перечень нерастворимых ферментов, выпускаемых фирмой MiLes Laboratories Ltd., приведен в табл. 7.2. К СМ- и DEAE-целлюлозе ферменты присоединяют азидным методом [65], с помощью триазиновых производных [50], или по методу Баркера [5] путем диазотирования 2-окси-З-(л-аминофенокси) пропи-лового эфира целлюлозы. Иммобилизованные на целлюлозе ферменты содержат относительно мало белка. Ферменты с высоким содержанием белка получают путем связывания белков с сополимером этилена и малеинового ангидрида [54]. Ферменты, присоединенные к агарозе триазиновым методом, характеризуются высокой ферментативной активностью главным образом по отношению к макромолекулярным субстратам [50]. Препараты рекомендуется хранить в среде с pH не ниже 5,0. [c.33]

Принцип стерического исключения субстрата был использован также для разработки метода определения макромолекулярных антигенов, таких, как альбумин, иммуноглобулины G и М. В анализе используют конъюгат антигена с р-/)-галактозидазой Е. соИ. После образования комплекса с антителами активный центр фермента становится недоступным для взаимодействия с искусственно синтезированным макромолекулярным субстратом о-Нитрофенил-Р-/)-гатактозидом, ковалентно связанным с водорастворимым полимерным декстраном. В присутствии антигена степень ингибирования фермента уменьшается пропорционально концентрации исследуемого соединения. Метод позволяет измерять IgG в микро-граммовых количествах в течение нескольких минут. [c.116]

Применив в качестве метки флуорогенный субстрат, Нго впервые разработал метод без разделения компонентов для определения макромолекул (Ngo, 1979, 1981). К IgG человека ковалентно присоединяют метку — производное р-галактозилум- еллиферона. IgG человека, меченный флуорогенным субстратом, служит одновременно макромолекулярным субстратом для [c.18]

В Исследовательском институте Syva разработаны два типа гомогенных методов иммуноферментного анализа для высокомолекулярных веществ. Методы первого типа связаны с применением -галактозидазы и макромолекулярного субстрата (Gibbons et al., 1980). Методы второго типа основаны на использовании ферментных каналов (Litman et al., 1980) с участием двух или большего числа ферментов. В этой главе мы рассмотрим принципы, особенности, ход выполнения и клинические приложения методов обоих типов. [c.103]

Полученный макромолекулярный субстрат был использован для иммуноаиализа сывороточных белков (Gibbons et al., 1980), Необходимые реагенты и принцип метода представлены на рис. 8-2. [c.104]

Если приготовить смешанный реагент, содержащий макромолекулярный субстрат и антитела, то можно воспользоваться методикой экспрессного анализа с применением двух реагентов. На рис. 8-3 приведена такая методика для определения в сыворотке С-реактивного белка — чувствительного индикатора воспаления и некроза тканей (Pepys, 1981). Набор реагентов для этого варианта анализа имеется в продаже. Метод рассчи- [c.105]

Рис. 8-4. Турбидиметрический анализ многовалентных антигенов, основанный на активировании фермента. Многовалентный антиген из образца последовательно реагирует с антителами, меченными -галактозидазой, и модифицированными антителами, несущими большой отрицательный заряд (вследствие обработки янтарным ангидридом). В образующемся комплексе фермент окружен отрицательными зарядами. При анализе с помощью поликатиояного макромолекулярного субстрата (см. рис. 8-1) ферментный конъюгат, входящий в состав комплекса, проявляет большую активность по сравнению со свободным конъюгатом или конъюгатом, связанным только с антигеном, Аг — антиген, Ат — антитело, Ф — фермент

При использовании флуорогенного макромолекулярного субстрата вместо хромогенного было достигнуто тысячекратное увеличение чувствительности иммуноанализа на основе ингибирования фермента (Armenta et al., 1985). Заменив в дедсстра-новом субстрате о-нитрофенилгалактозид галактозидом умбеллиферона, получили соединение, показанное на рис. 8-8. С помощью этого субстрата и обычного флуориметра можно с точностью 1% быстро (время считывания 30 с) определять -галактозидазу в концентрациях, в тысячу раз меньших по сравнению со спектрофотометрическим анализом. [c.110]

Все три метода анализа, описанные в этой главе, основаны на сильных взаимодействиях между антителами и полимерным субстратом. Нативные антитела почти не заряжены и при свя зывании с антигеном, меченным с помощью фермента, иигиби-руют каталитическую активность за счет блокирования контактов с высокомолекулярным субстратом. Как и следовало ожидать, увеличение размеров макромолекулярного субстрата а также присоединение к антителам вторых антител (антним-муноглобулинов) усиливают ингибирование ( r6wl е а ., 1980). [c.113]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология