Обесцвечивание гелей

ОБЕСЦВЕЧИВАНИЕ ГЕЛЯ ПОСЛЕ ДИСКРЕТНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ [c.308]

ПОЛНОГО обесцвечивания геля его вымачивают перед высушиванием в 10%-ной уксусной кислоте, содержащей 1 % глицерина. [c.159]

Перевернутые чашки инкубируют при постоянной температуре в хорошо термостатируемой комнате или камере (разд. 6.3). Лучше использовать закрытые контейнеры, однако их не следует перегружать чашками. Если тем не менее без этого не обойтись, увеличивают время для выравнивания температуры чашек и камеры, что особенно важно при работе с температурочувствительными мутантами. Инкубация в закрытых контейнерах позволяет также избежать токсического воздействия вредных газов, которые могут присутствовать в атмосфере термостатируемых помещений общего назначения (например, паров уксусной кислоты, используемой для обесцвечивания гелей). Непрозрачные контейнеры защищают светочувствительные компоненты сред и красители от инактивации светом. Наконец, в контейнерах среда в чашках не высыхает, и поэтому такие чашки пригодны для наблюдения за медленно развивающимися или поздно появляющимися колониями. Еще одной проблемой является поддержание необходимой концентрации СОг, поскольку в СОг могут нуждаться даже организмы, выделяемые обычно в отсутствие высоких концентраций этого газа. Эта зависимость особенно наглядно выявляется в случае нанесения на агар отдельных редких клеток из разбавленных суспензий и при инкубации в обыч- [c.463]

Если величины pH устанавливают описанным методом, то нужно иметь по крайней мере два параллельных столбика геля, в которых сфокусированы образцы одного и того же белка. Один гель служит для выявления положения белка, а другой — для регистрации градиента pH. В процессе окрашивания и обесцвечивания гелей их размеры часто меняются, поэтому для получения сравнимых результатов следует принимать во внимание возможность их набухания и сжатия. [c.159]

При окрашивании и обесцвечивании гели набухают, а краситель, маркирующий фронт (обычно бромфеноловый синий), вымывается поэтому значение Rf для белков следует рассчиты- [c.224]

Обесцвечивание фона можно проводить путем четырехкратного промывания гелей 0,05%-ной уксусной кислотой. Другие авторы 478] применяли для окрашивания белков после изотахофореза раствор, содержащий 50 мг хлористой ртути и 0,5 г бромфенолового синего в 500 мл 50%-ного водного этанола. Для обесцвечивания гели вымачивали в 30%-ном этаноле и 5%-ной уксусной кислоте [478]. [c.271]

Метод включения в гель субстрата или затравки. При использовании высокомолекулярного субстрата или затравки инкубация геля в растворе субстрата дает лишь весьма посредственные результаты, поскольку субстрат плохо проникает в гель и реакция происходит только на его поверхности. Проблема может быть решена путем включения субстрата в гель перед проведением электрофореза. В этом случае гели после электрофореза инкубируют в буферном растворе с подходящим значением pH или во влажной камере, а затем проводят окрашивание макромолекулярного субстрата. После обесцвечивания гелей в местах локализации фермента выявляются бесцветные или менее интенсивно окрашенные полосы. При использовании техники включения субстрата в гель должны выполняться два [c.280]

Окраска и обесцвечивание гелей. После окончания электрофореза гели окрашивали в водном растворе, содержащем [c.57]

Окрашивание и обесцвечивание. Гели опускают в небольшие пробирки с окрашивающим раствором. Раствор готовят из 1,25 г красителя кумасси ярко синего в смеси 454 мл 50%-ного метанола и 46 мл ледяной уксусной кислоты с последующим от-фильтровыванием нерастворившегося материала через ватман № 1. Окрашивание длится 2—10 ч при комнатной температуре. Затем гель удаляют из окрашивающего раствора, споласкивают дистиллированной водой и помещают в раствор для удаления избытка краски (обесцвечивания), состоящий из 75 мл ледяной уксусной кислоты, 50 мл метанола и 875 мл воды, не менее чем на полчаса. Далее гель обесцвечивают электрофоретически в том же аппарате в течение 2 ч, используя раствор для обесцвечивания. Длина геля после обесцвечивания, а также положения зон белков, окрашенных в синий цвет, измеряются. Гели хранят в 7,5%-ной уксусной кислоте. [c.423]

В кислых растворах, используемых для окрашивания и обесцвечивания, гели набухают на 5%. При более низком содержании поперечных сшивок набухание сильнее. Следовательно, расчет подвижности должен учитывать кроме расстояний, пройденных зонами белка и маркерного красителя, также длину геля до и после обесцвечивания. Предполагая, что набухание ириислидит равномерно, можно рассчитать подвижность, пользуясь следующим соотношением [c.423]

Обесцвечивание гелей после обнаружения зон кумасси синим происходит с достаточной скоростью в процессе диализа в 12,5%-НОЙ трихлоруксусной кислоте. Самым простым, но длительным способом удаления из геля избытка амидового черного 10В также является обычный диализ. Гели, имеющие форму [c.308]

Гели извлекают и окрашивают одним из принятых, способов. Например, по методике Грэсслина и др. [73],. гели окрашивают при осторожном перемешивании в течение 30—60 мин в 0,2%-ном растворе кумасси яркого синего 0-250 в смеси этанол — вода — ледяная уксусная кислота (45 50 5, объем/объем). Для обесцвечивания гелей их обрабатывают тремя порциями смеси этанол — вода — ледяная уксусная кислота (40 55 5) в течение 2 ч. [c.277]

В некоторых случаях, например когда в результате длительной очистки удается получить лишь очень малые количества материала ИЛИ при необходимости исследовать компоненты отдельных клеток, приходится прибегать к микроварианту электрофоретического разделения белков и нуклеиновых кислот. В то же время микроанализ в полиакриламидном геле сам по себе обладает рядом преимуществ. Так, более короткое время, затрачиваемое на проведение электрофореза, а также на окрашивание и обесцвечивание гелей, делает применение микроанализа целесообразньгм даже тогда, когда материала вполне достаточно для макроварианта. Микрометодика при наличии определенного опыта едва ли намного сложнее обычного диск-электрофореза, хотя требует такого специального оборудования, как микропипетки, микроманипулятор, лупа и микроденситометр. Читатели, интересующиеся деталями этого метода, могут обратиться к монографии Нейхоффа [915], в которой поми мо электрофореза освещены и другие виды работ с микроколичествами материала (гомогенизация, диализ, фотометрия, центрифугирование в капиллярах и т. д.). [c.107]

Простейший способ обсцвечивания фона состоит в вымачивании поддерживающей среды в жидкости, в которой свободный краситель хорошо растворяется, а его комплексы с макромолекулами не диссоциируют. Такой растворитель (часто смесь растворителей) либо идентичен растворителю, использованному для получения окрашивающего реактива, либо имеет другой состав. Процесс обесцвечивания гелей путем их вымачивания занимает много времени. Один из способов его ускорения — это частая смена растворителя, который можно использовать многократно, если удалять из него экстрагированный краситель, например, посредством адсорбции на активированном угле. Нетрудно изготовить специальное устройство для непрерывной замены и очистки обесцвечивающего раствора. С этой целью к сосуду с обесцвечивающим раствором присоединяют насос, который прокачивает его через слой активированного угля и вновь возвращает в ванну с отмываемыми гелями [198]. Еще более простой, хотя и менее эффективный способ непрерывной очистки обесцвечивающего раствора заключается в том, что в него помещают диализный мешок, наполненный активированным углем. Перемешивание раствора также помогает увеличить скорость обесцвечивания. Если такая автоматическая система применяется для обработки столбиков полиакриламидного геля, то их целесообразно сначала вложить в перфорированные пробирки, прежде чем погружать в обесцвечивающий раствор. [c.188]

Вольф [1442] инкубировал гели с низкомолекулярной РНК. Затем гели окрашивали красителем для РНК. После обесцвечивания гелей положение рибонуклеазной активности определяли по появлению менее интенсивно окрашенных полос. Быстрый метод подобного типа описан Уилсоном [1431]. [c.294]

Поскольку высокомолекулярные РНК не мигрируют в полиакриламидных гелях, их включение в состав геля не вызывает каких-либо осложнений. РНК добавляют к гелеобразующему раствору и электрофорёз проводят обычным способом. После электрофореза гели инкубируют в буферном растворе, фиксируют и окрашивают красителем для РНК. После обесцвечивания гелей появляются менее интенсивно окрашенные полосы, указывающие местонахождение ферментативной активности [1057]. В качестве субстрата в гель включают и полиуридиловую кислоту в конечной концентрации 0,05%, [780]. После электрофореза при pH 9,5 гели инкубируют 2 ч в 7%-ной уксусной кислоте. В течение этого времени pH геля снижается почти до 2,0. Таким образом, ферменты с различными оптимумами pH могут расщеплять синтетические полинуклеотиды, прежде чем подвергнуться инактивации. Затем гели окрашивают, оставляя их на ночь в 1%-ном растворе пиронина в 7%-ной уксусной кислоте. Обесцвечивание гелей проводят в 7%-ной уксусной кислоте. [c.294]

Пикок и Дингман [983] использовали в качестве красителя метиленовый синий, растворенный в ацетатном буфере (pH 4,7) в конечной концентрации 0,2%. После электрофореза комбинированные полиакриламидно-агарозные гели вымачивали 10— 15 мин в растворе уксусной кислоты и затем окрашивали. Обесцвечивание гелей проводили путем их промывания в нескольких сменах воды или проточной водой. На этом этапе следует проявлять осторожность, так как при длительном обесцвечивании краситель вымывается и из зон нуклеиновых кислот. Гели, окрашенные метиленовым синим, можно хранить в течение нескольких месяцев в герметичной упаковке из полиэтилентере-фталатной пленки saran wrap [1232]. [c.384]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология