Иммуноглобулины неспецифические

Осаждение иммуноглобулинов легко осуществить высаливанием при нейтральном pH, при котором они малорастворимы, так что в случае меченого антигена связанную метку можно осадить из раствора вместе с оставшимся свободным антителом, оставляя, таким образом, свободную метку на поверхности. В качестве соли предпочитают использовать сульфат аммония, но недостатком метода в таком случае является высокий уровень неспецифического связывания. [c.577]

После перемешивания в течение 30 мин при 4°С суспензии разделяли центрифугированием в течение 10 мин (50 об/мин). Концентрацию а+-цепей в растворе определяли на основании измерений С-радиоактивности. Количество связанных а+-цепей рассчитывалось по разности общего содержания добавленных а+-ценей и определенным в растворе количеством свободных а+-цепей. Одновременно по связыванию таких же количеств человеческого иммуноглобулина О на агарозе в тех же условиях определялись поправки на неспецифическое связывание и включение жидкой фазы в матрицу. [c.373]

Получение сыворотки представляет собой лишь начальный этап приготовления нужного реагента. Для большинства методов необходима лишь иммуноглобулиновая фракция, остальные компоненты сыворотки могут быть отброшены. Это приводит к снижению отношения общего белка к антителам, уровня неспецифических реакций и к увеличению чувствительности метода. Процесс мечения антител флуорохромом, ферментом или изотопом, а также очистку методом аффинной хроматографии начинают с выделения иммуноглобулинов. [c.34]

После блоттинга нитроцеллюлозную мембрану хранят в буфере для отмывания (PBS-твин) между двумя листами фильтровальной бумаги до окрашивания. Добавление твина существенно для блокирования участков неспецифического связывания иммуноглобулинов а стадии иммунохимического окрашивания. [c.232]

Для того чтобы тест связывания с антителами был эффективным, а фон неспецифического связывания.—низким, необходимы чистые препараты меченых антител. Большая часть мышиных IgG связывается с белком А. Эти иммуноглобулины могут быть, легко очищены на колонке с иммобилизованным белком А. Получаемые при этом чистые препараты антител характеризуются очень низким уровнем неспецифического связывания. Мышиные IgM и крысиные иммуноглобулины проще всего высаливать,, однако получаемые при этом препараты содержат примеси. [c.221]

В той или иной степени с проблемой фоновой активности приходится сталкиваться практически во всех работах по ИФА антител. Это связано как с чрезвычайно высокой чувствительностью самого метода, так и с тем, что для сыворотки характерен очень высокий уровень содержания иммуноглобулинов, в особенности IgG. Во время инкубации дисков, несущих иммобилизованные антигены, непосредственно с конъюгатом или после их предварительной инкубации в растворе, которым разводят пробы, неспецифического связывания ферментной метки практически не происходит. Вместе с тем при инкубации с образцами сыворотки, которые, предположительно, не содержат [c.200]

Рабочие титры антител определяют в реакции ИФА методом шахматного титрования с использованием сэндвич -метода ИФА. Суть метода заключается в использовании подложки , т. е. слоя неспецифически сорбированных иммуноглобулинов, с которыми затем взаимодействует специфический антиген. Этот антиген в дальнейшем выявляется с помощью конъюгатов антител с ферментной меткой. Схема сэндвич -метода представлена на рис. 38. 96-луночный микропланшет заполняют раствором антител в концентрации 10 мкг/мл по 100 мкл в лунку и оставляют на ночь при 4 С. На следующий день после 3-кратного отмывания фосфатным буфером с твином-20 (с. 321) титруют положительный антиген по короткому ряду микропланшета, так же титруют отрицательный антиген . После инкубации в течение 1 ч при 37° С и последующего 3-кратного отмывания в таких же условиях титруют конъюгат антител в буфере по длинному ряду микропланшета. [c.319]

Использование иммобилизованных антигенов позволяет выделить фракцию иммуноглобулинов, специфических антител против белка (рис. 4.ЮЛ). Полученный таким путем высокоочищенный специфический реагент может быть использован в случаях, когда Ьн требуется, как, например, в иммуногистологии. Существенным недостатком этих методов являются жесткие условия десорбции антител. Чтобы смягчить денатурирующий эффект от снижения pH до 2,8 (условие, нередко используемое для десорбции антител), десорбированные фракции необходимо собирать в буферном растворе, pH которого близок к нейтральному. В этих условиях восстановленные антитела обычно активны. В то же время, если иммобилизованный антиген чист, эта операция позволяет удалить неспецифические примеси антител, временами присутствующие во фракции иммуноглобулинов. [c.109]

Иммунный статус определяется количеством и активностью циркулирующих лимфоцитов и макрофагов, состоянием системы комплемента, факторов неспецифической резистентности, количеством и функцией киллерных клеток, концентрацией иммуноглобулинов, специфических АТ, интерлейкинов, гормонов тимуса и другими показателями. [c.89]

Условные сокращения НС — гемоцианин из Helix pomatia IG — неспецифический v-иммуноглобулин человека AD — алкогольдегидрогеназа дрожжей НЬ — карбоксигемогло-бин взрослого человека СА — карбангидраза В из эритроцитов человека LY — лизоцим белка куриного яйца. Числа, стоящие рядом с символами, представляют собой значения молекулярных масс. Скорость релаксации чистого растворителя указана горизонтальной штриховой линией. [c.165]

ТОК, продуцирующих данный класс иммуноглобулинов. При этом, чтобы такой клон ответил усилением продукции иммуноглобулинов, во всех случаях необходима предварительная специфическая (антигеном) или неспецифическая (митогеном) стимуляция отвечающих клеток. [c.118]

Если наивные Т-клетки распознают комплекс на поверхности макрофагов, поглотивших патоген, то такие клетки дифферн-цируются в D4 Т-клетки воспаления, активируют макрофаги и тем самым способствуют внутриклеточному перевариванию (уничтожению) патогена. Путь проникновения антигена в клетку может осуществляться не только за счет неспецифической адгезии патогена на поверхности макрофагов, но и посредством специфического взаимодействия с предсуществующими антигенраспознающими рецепторами (поверхностными иммуноглобулинами) В-клеток. Экспрессия переработанного антигена в комплексе с молекулами II класса на поверхности В-клеток включает в ответ наивные Т-клетки, дифференцирующиеся в хелперные D4 Т-клетки. В этом случае хелперные D4 Т-клетки оказывают помощь В-клеткам в продукции антител, т.е. в формировании гуморального иммунного ответа. [c.200]

Этап III. В разрушении и отторжении трансплантата участвуют перечисленные выше клеточные формы и специфические иммуноглобулины. Цитотоксические Т-лимфоциты ( D8 Т-клетки) и НК-клетки вступают в специфическую реакцию разрушения трансплантата первые — за счет собственных антигенраспознающих рецепторов, вторые — за счет цитофильных антител. Т-клетки воспаления (Тн1) после взаимодействия с антигенами трансплантата начинают активную секрецию хемотаксического макрофагин-гибирующего фактора, привлекающего в зону отторжения макрофаги, способные к неспецифическому лизису трансплантата (по своей форме это — типичная реакция воспаления). Клетки трансплантата неспецифически лизируются также активированными цитокинами натуральными киллерными клетками. [c.211]

Таким образом, в реакцию отторжения трансплантата включаются как специфические участники — DS Т-клетки (ЦТЛ), D4 Т-клетки воспления (ТнО, специфические иммуноглобулины, так и неспецифические — активированные макрофаги и натуральные киллеры. [c.211]

Связывание Т-клеточным рецептором комплекса антигенный пептид молекула I или II класса МНС — обязательное, но недостаточное условие для трансформации наивных Т-клеток в зрелые эффекторы. Необходим второй неспецифический сигнал. Кости-муляторами в данном случае выступают экспрессирующиеся на поверхности антигенпрезентирующих клеток молекулы В7, относящиеся к суперсемейству иммуноглобулинов. [c.236]

Трансплантационный иммунитет представляет собой специфическую реакцию организма на генетически чужеродный биологический материал, проявляющуюся в отторжении неродственного трансплантата и создании иммунологической памяти от первичного контакта с чужеродностью. Иммунная реакция отторжения трансплантата носит комплексный характер и включает как специфические, так и неспецифические компоненты Основными участниками отторжения являются цитотоксические D8 Т-клетки. Кроме того, в реакции принимают участие специфические иммуноглобулины, а также СЕМ Т-клетки воспаления, макрофаги, натуральные киллеры. Макрофаги и другие фагоцитирующие клетки являются участниками воспалительной реакции, развивающейся в зоне отторжения трансплантата. [c.454]

Ранее был описан активированный перйодатом сефадекс (0-50 или 0-75) [6]. После присоединения иммуноглобулина и восстановления шиффовых оснований полученные иммуноадсорбенты характеризовались очень низким неспецифическим связыванием, но гели оказались механически весьма неустойчивыми и быстро забивались. Кроме того, гели имели очень низкую емкость, потому что антитела исключались из внутреннего объеме шариков. Хотя агароза имеет больший размер пор, этот гель активируется периодатным окислением в незначительной степени, так как реакция протекает только по концам цепей полисахаридных молекул. Однако периодатным окислением может быть активирована поперечно-сшитая агароза. В результате побочной реакции, сопровождающей процесс поперечной сшивки с эпихлорогидрином, на геле образуются гликоли. Периодатное окисление этих гликолей приводит к альдегидам, которые могут реагировать с аминогруппами белка. Образовавшиеся шиффовы основания могут быть далее восстановлены, как описано для других матриц. Иммуносорбенты, полученные таким путем, характеризуются очень хорошими хроматографическими свойствами, сочетая жесткость агарозных шариков с химической стабильностью и низким неспецифическим связыванием. Могут быть достигнуты высокие скорости потока даже при использовании таких хаотропных агентов, как 6,0 М солянокислый гуанидин [7]. [c.68]

На первой стадии иммобилизованные антивидовые антитела связывают из раствора все антитела соответствующего вида. Наличие антител определенной специфичности в образовавшихся иммунохимических комплексах выявляют титрованием антигенсвязывающих центров конъюгатом соответствующего антигена с ферментом. Метод основан на выявлении из множества связавшихся с иммуносорбентом антител молекул только одной специфичности, поэтому возможность его эффективного применения снижается при способности меченого антигена к неспецифическому связыванию с иммобилизованными на носителе белками или адсорбировавшимися на них после первой инкубаций иммуноглобулинами. [c.92]

Получение меченых антител для анализа методически более просто. Методы синтеза и очистки конъюгатов различных ферментов с иммуноглобулинами в настоящее время хорошо разработаны и унифицированы. С помощью имеющихся стандартных методик получают активные и стабильные препараты, что упрощает разработку методов иммуноферментного определения различных соеди-ненцй. В ИФА могут быть использованы меченая глобулиновая фракция или IgG-фракция антител, аффинно выделенные антитела или их РаЬ-фрагменты. Целесообразность применения того или иного препарата следует оценивать применительно к конкретному случаю. Однако необходимо отметить, что применение меченой глобулиновой или IgG-фракции антител приводит к значительному (до 90%) непроизводительному расходу фермента-маркера, вследствие чего возрастает как стоимость анализа, так и вероятность усложнения интерпретации его результатов за счет увеличения вклада неспецифических взаимодействий. [c.101]

Получение фрагментов антител. При разработке некоторых модификаций ИФА может возникнуть необходимость использования конъюгатов фермента не с целой молекулой иммуноглобулина, а с тем ее фрагментом, который специфически связывается с молекулой антигена —Fab-фрагментом. Обусловлено это прежде всего тем, что рс-фрагмент молекулы, ответственный за эффек-торные функции иммуноглобулина, обладает способностью неспецифически взаимодействовать с другими белками, сорбированными на носителях при проведении твердофазного ИФА. Эффект неспецифической сорбции определяется природой антигена, концентрацией сорбированного на носителе белка и рядом других факторов. [c.155]

После иммобилизации антител (антигена) часть центров сорбции носителя экранируется связанным белком и становится недоступным для взаимодействия с компонентами анализируемой пробы и ферментным конъюгатом. В связи с этим наиболее ценную для анализа информацию дает сравнение эффективности сорбции меченного пероксидазой инсулина на двух иммуносорбентах, один из которых содержит иммобилизованные специфические антитела, а другой — антитела неиммунизированного животного (рис. 26). Подобный эксперимент позволяет учесть суммарное неспецифическое связывание с носителем и иммобилизованными иммуноглобулинами, но не дает возможность различить эти два эффекта. [c.215]

Аналогично определяют антитела, способные агглютинировать латексные частицы, на которые нанесены антигены. Агглюти-нируюшую активность антител иммуноглобулина G (IgG) можно усилить ревматоидным фактором IgM (RF). RF выгодно отличается от антисыворотки против иммуноглобулинов тем, что не требует операции промывки для удаления несвязанных иммуноглобулинов. Неспособность некоторых антигенов, например фосфолипазы А2 - аллергена пчелиного яда [9 ] и антигена вируса Herpes simplex [10], к солюбилизации может привести к неспецифическому связыванию иммуноглобулинов. Этот источник ошибок можно устранить с помощью частиц латекса, на которые нанесены антитела. Такие частицы агглютинируют в присутствии антигена. Тоща изучаемые антитела можно определять титрованием, воспользовавшись их способностью ингибировать агглютинацию. [c.224]

Предлагаемая мною гипотеза, конечно, нуждается в доптнительных подтверждениях. Но она служит основой тля далеко идущих предположений общебиологического плана. Например, проблемы так называемых неспецифических или нормальных иммуноглобулинов. Иммунологам хорошо известно, что одновременно с синтезом антител образуется большое количество иммуноглобулинов, которые никакие известные лиганды, в том числе и использованный антиген, не связывают. Число продуцирующих их клеток хможет намного превышать число ан-тителЬпродуцирующих клеток (Е. Сидорова и др., 1981). По всем признакам (общий план строения, антигенный анализ) нормальный иммуноглобулин отличается от антител только одним он не связывает известных лигандов. На основании обсуждавшихся данных рентгеноструктурного анализа мы ставим на обсуждение предположение о том, что нормальные иммуноглобулины — это энергетически устойчивая конформация молекулы имму- [c.100]

Фрагменты иммуноглобулинов с хемотактическими свойствами. К хемотактическим факторам относят вещества, вызывающие перемещение различных клеток крови (моноциты, сегментоядерные лейкоциты, лимфоциты) по направлению градиента концентрации фактора. Хемо-тактические факторы служат одним из важнейших инструментов процесса воспаления, без преувеличения, главной защитной неспецифической реакцией организма на повреждающие воздействия. [c.162]

В период становления техники иммуносорбции (конец 50-х годов) внимание специалистов привлек амино-полистирол — коммерческий препарат низкой стоимости, который без особых затрат и потери рабочего времени мог быть использован в качестве носителя для фиксации белковых антигенов. В самом деле, аминогруппы амино-полистирола можно диазотировать нитритом натрия в разбавленной соляной кислоте. Затем с помощью реакции азосочетания в слабощелочной среде к полихмеру можно ковалентно присоединить любые белки, содержащие тирозин. Однако полученные таким способом иммуносорбенты связывали неспецифически значительные количества сывороточных иммуноглобулинов, видимо, за счет гидрофобных взаимодействий. От этого полимера как носителя пришлось отказаться. [c.244]

Во-первых, в зависимости от области применения существует возможность выбора наиболее подходящего и удобного источника получения моноклональных антител культуральной или асцитной жидкости. При использовании препаратов асцитной жидкости возникают определенные трудности при интерпретации полученных результатов, обусловленные примесью естественных мышиных антител к моноклональным антителам (высокие фоновые уровни). Однако в 1 мл асцитной жидкости содержится несколько мг МКА. Поэтому, когда используют разведение 1 1000 или более, значительная часть посторонних мышиных антител удаляется разбавлением. Иногда необходимо полностью удалить из препарата примесь естественных иммуноглобулинов (например, при использовании моноклональных антител для выделения и очистки небольшого количества белкового антигена с целью биохимического анализа). В последнем случае предпочтительно выделять моноклональные антитела из культуральной жидкости. При использовании в иммунологических реакциях асцитной жидкости следует иметь в виду присутствие посторонних фоновых антител. В некоторых случаях в организме мыши может существовать высокий титр природных антител, реагирующих с антигеном, специфически распознаваемым моноклональными антителами. При использовании асцитной жидкости возникают и проблемы неспецифического характера. Например, культуральная жидкость дает более ясное и точное окрашивание образца в иммуногистологических исследованиях. [c.148]

Существуют два метода иммунохимического окрашивания. В первом используют антитела, меченные радиоактивным иодом, а затем проводят авторадиографию. Второй метод основан на принципе ELISA и предусматривает использование антител к иммуноглобулинам, конъюгированных с ферментом, и реакцию локального окрашивания, когда субстрат. превращается в нерастворимый окрашенный продукт в участках расположения комплексов антиген — антитело [10]. При использовании любого метода возникают проблемы неспецифического связывания, которые в обоих случаях решаются одинаково. Благодаря простоте и возможности длительного хранения реагентов иммуноферментный метод применяют чаще, за исключением тех случаев, когда требуется высокая чувствительность. Ниже приведено описание иммуноферментного метода, а в технических замечаниях описана процедура авторадиографии. Методы приготовления антител к иммуноглобулинам описаны [c.232]

ДЛЯ определения антигенов клеточной поверхности лимфоидных клеток мышей используют крысиные МА, применение непрямого варианта ИФМ с меченными флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) мышиными МА против иммуноглобулинов крыс обеспечивает достаточную чувствительность определения при этом практически не возникает проблем с неспецифическим фоновым связыванием. Связывание с F -фрагментом в этой системе не вызывало дополнительных затруднений, если предпринимались меры против образования агрегатов. [c.179]

Одна из наиболее трудных проблем при цитометрии связана с неспецифическим окрашиванием. Клеточный сортер с чрезвычайно высокой чувствительностью детектирует флуоресцирующие молекулы — обычно с большей, чем глаз. Поэтому реагенты, используемые при работе с сортером, должны быть более высокой степени очистки, чем для других методов анализа. Как правило, гетерологичные сыворотки должны подвергаться очистке на аффинных сорбентах даже в тех случаях, когда они достаточно специфичны для непосредственного использования при флуоресцентной микроскопии. Моноклональные антитела не всегда требуют очистки. Мы с успехом использовали супернатанты многих продуцирующих моноклональные антитела гибридом, которые культивировали в средах с добавлением и без добавления сыворотки, а также асцитные жидкости (конечно, в соответствующем разведении). В случае непрямых методов флуоресцентного окрашивания влияние контаминирую-щих молекул в культуральных жидкостях сводится к минимуму. Если конъюгированные с флуорохромом антитела строго специфичны по отношению к иммуноглобулинам, то даже при связывании клетками молекул, не относящихся к иммуноглобулинам, эти молекулы не будут детектироваться (по флуоресценции). В случае применения асцитных жидкостей активность моноклональных антител обычно настолько высока, что эффекты контаминирующих иммуноглобулинов и других компонентов чаще всего не выявляются. Однако при прямом конъ-югировании препаратов антител с флуорохромом наличие в них белковых примесей неиммуноглобулиновой природы может стать причиной высокого уровня неспецифического окрашивания. Следовательно, любой конъюгат используемый при сортинге клеток, должен быть тщательно очищен. [c.332]

В чашку Петри 100X20 мм (Fal on, номер по каталогу 1005) пипеткой наливают 6 мл раствора антител, содержащего кроличьи антитела против иммуноглобулинов овцы (10 мкг белка/мл) и кроличьи IgG (70 мкг белка/мл), и инкубируют чашку Петри при 4°С в течение ночи. (Антитела против иммуноглобулинов овцы можно использовать повторно.) Включение в смесь неспецифических кроличьих IgG уменьшает связывание имеющих поверхностные иммуноглобулины В-клеток с поверхностью чашки Петри, что способствует их легкому освобождению при промывке струей раствора из пипетки на этапе 7 описываемой процедуры. [c.460]

Неспецифическое связывание можно оценить в контрольных ячейках с глобулином, не содержащим антител, взятым в той же концентрации, что и иммуноглобулин в опытных ячейках. Однако положительный результат — это скорее предупреждение об артефакте, чем точная мера неспецифического связывания. Отдельные препараты, особенно моноклональные антитела, могут сильно отличаться от средних контрольных глобулинов по интенсивности не-спецнфического связывания в ту и другую сторону. [c.27]

При хроматографии не следует перегружать колонку белком, особенно в тех случаях, когда сыворотка содержит большое количество иммуноглобулинов (миеломные сыворотки или сыворотка при макроглобулинемии Вальденстрёма), так как белки могут элюироваться раньше, чем обычно, и загрязнять друг друга. Однако нужно также избегать избытка адсорбента по отношению к белкам сыворотки, который может быть причиной повышенной неспецифической адсорбции иммуноглобулинов. Как правило, перед фракционированием больших количеств белка следует провести предварительное разделение небольшого количества. [c.60]

Перед специфической очисткой желательно удалить примеси, которые могли бы неспецифически связаться с иммуносорбентом или иммунцым преципитатом. Кроме того, из лейкоцитарного лизата нужно удалить меченые иммуноглобулины, связанные с клеточной поверхностью (если они сами не являются предметом исследования, см. гл. 2), иначе они попадут в преципитат, взаимодействуя с антиглобулииовым реагентом или стафилококками, несущими белок А. Эти примеси обычно удаляют путем осаждения или адсорбции перед этапом специфической очистки. [c.181]

После обработки мазка аллоантисывороткой к клеткам линии, отличной от стимулирующих и отвечающих клеток, число таких Т-бластов обычно слегка повышается (дополнительно на 2—4%), Этот эффект наблюдается даже после истощения антисыворотки стимулирующими и отвечающими клетками и объясняется скорее всего остаточной перекрестной реактивностью антисыворотки или же неспецифическим захватом клетками иммуноглобулина из этой антисыворотки. Хотя общее число бластов, флуоресцирующих без обработки аллоантисывороткой, может достигать 6,9%, гипериммунная антисыворотка, выявляющая аллоантигены стимулирующих клеток, окрашивает в 9,2—11,8 раз больше Т-бластов, чем антисыворотка к третьей, неродственной линии. [c.315]

Наличие гидрофобных или заряженных групп на поверхности, как правило, приводит к росту неспецифической адсорбции белков. Адсорбция человеческого иммуноглобулина G (hIgG) и бычьего альбумина (БСА) исследовалась на монослоях тиолов на золоте с различными концевыми группами [544]. Адсорбция liIgG уменьшалась в ряду функциональных групп СНз > gHsOH > С00 > [c.501]

Влияние концентрации антигена на неспецифическое связывание. На первом этапе компоненты образца и компоненты системы определения могут связываться непосредственно с полистиролом даже в присутствии 0,05% твина-20 (неопубликованные данные). Непосредственное связывание компонентов образца может приводить к дополнительному артефактному обнаружению иммуноглобулинов, не обладающих специфичностью к данному антигену, а адсорбция на пластике самих компонентов системы определения вызывает фоновое связывание, которое может существенно искажать кривые титрования. Оба названных процесса протекают не очень интенсивно и, вероятно, оказывают лишь незначительное влияние на точность определения в системах ELISA с относительно низкой чувствительностью. Однако в случае систем, предназначенных для тестирования специфических антител в низких концентрациях, эти же процессы могут очень значительно искажать результаты анализа. [c.220]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология