Крупнопористый гель

Схема проведения опыта стеклянные трубки последовательно заполняют смесью реактивов, из которых вначале полимеризуется мелкопористый, а затем — крупнопористый гель, после чего трубки соединяют с электродными камерами, которые заполняют буферным раствором так, чтобы в него погрузились верхний и нижний концы трубок. Сверху под буфер в трубки вносят исследуемый образец. После электрофореза гель извлекают из трубок, фиксируют и определяют исследуемые вещества. [c.148]

При разделении белков методом ГПХ компоненты смеси могут иметь очень близкие константы распределения / av Для разделения подобных смесей можно, конечно, воспользоваться более длинной колонкой. Однако при увеличении столбика геля возрастает гидродинамическое сопротивление, а следовательно, падает скорость элюирования. В то же время нельзя допускать большого перепада давления, в особенности при работе на легко деформирующихся крупнопористых гелях, пригодных для разделения белков. [c.426]

Фиг. 32. Хроматографирование стандартов полистирола (см. табл. 20) на крупнопористом геле полистирола [47]. По оси ординат —концентрация в произвольных единицах.

Возможности этих методов ограничиваются только пригодностью изучаемых гликопротеинов для фракционирования на колонках. Автор нашел, что некоторые эпителиальные гликонротеины очень прочно прилипают к ионообменной целлюлозе и к большинству других хроматографических наполнителей. Многие эпителиальные гликопротеины хотя обычно и ведут себя нормально при гель-фильтрации, но, как уже отмечалось, имеют столь большие эффективные размеры молекул, что совершенно не удерживаются большинством крупнопористых гелей. Но даже и при этих обстоятельствах гель-фильтрация будет обнаруживать более низкомолекулярные примеси. Гель-фильтрация и ионообменные методы используются препаративно нет необходимости снова проверять материал, полученный в качестве единственного компонента при таком фракционировании, за исключение г тех случаев, когда нужно убедиться, что материал не подвергся деградации. [c.51]

Она широко используется как носитель для иммобилизации. Однако стоимость агарозы довольна высока, поэтому разрабатываются различные методы ее модификации с целью получения легко регенерируемых форм. При охлаждении горячего 2—6%-ного водного раствора агарозы до температуры ниже 45°С образуются прочные крупнопористые гели, представляющие собой сложную смесь из заряженных и нейтральных полисахаридов. В процессе образования геля индивидуальные полисахаридные цепи образуют двойные спирали, которые далее агрегируют с образованием узлов . При температуре около 100°С гель агарозы плавится, поэтому в отличие от сефадексов его нельзя автоклавировать. Высушивание агарозы приводит к необратимой деструкции геля, поэтому его необходимо хранить в виде водной суспензии. [c.14]

Крупнопористые гели, используемые для разделения высокомолекулярных веществ, получают путем полимеризации разбавленных растворов акриламида. При этом образуются очень непрочные гели, механические свойства которых можно улучшить, добавив к ним агарозу. [c.380]

Крупнопористые ПААГ [295, 244]. Крупнопористые гели используются для электрофоретического фракционирования макромолекул с молекулярными массами >10 Агарозные гели становятся темными при обработке комплексами серебра, поэтому описанная выше методика окрашивания не может быть к ним применена [35]. Ниже приводится методика окрашивания крупнопористых гелей, приготовленных на основе 2,55%-ного полиакриламида с 2,75% сшивок с метилен бис акрил амидом. [c.307]

В отличие от однородной системы, где в геле и в обеих камерах используется один и тот же буфер, при диск-электрофорезе используются буферы с различными pH, что создает прерывистые градиенты электрического потенциала и pH. Система включает крупнопористый концентрирующий гель с низким pH, расположенный над мелкопористым разделяющим гелем с высоким pH. Полипептиды быстро проходят через крупнопористый гель и концентрируются на поверхности разделяющего геля. Это позволяет получить хорошее разделение при использовании относительно больших объемов разведенных белковых растворов. [c.95]

Разделение антигенов в первом направлении путем электрофореза в теле агарозы базируется, в основном, на различии электрических зарядов белков, входящих в состав смеси, так как торможение миграции за счет трения в крупнопористом геле агарозы существенной роли не играет. Между тем, в ряде случаев белки-антигены желательно разделять по их размерам. Для этой цели электрофорез в первом направлении проводят в ПААГ. [c.150]

Чем же диктуется выбор значений Т и С Прежде всего, на этот выбор накладывают ограничения механические и адсорбционные свойства геля. Например, гели с и С=1 оказываются слишком мягкими и липкими — их невозможно извлечь из стеклянной формы. Для крупнопористых гелей надо увеличивать степень сшивки (повышать величину С до 3—5), т. е. от-, ношение акриламид/Бис брать в пределах от 35 1 до 20 1. При этом происходит одновременное повышение прочности геля и ухудшение его способности прилипать к стеклу —гель как бы замыкается . Мелкопористые гели (Г около 20) при высоком содержании сшивки оказываются хрупкими и мутными, поэтому для них величина С не должна превышать 1—2. [c.13]

Для эффективного разделения белков при электрофорезе в ПААГ соотношение 7 о должно составлять 0,1—0,2. Отсюда следует, что оптимальная электрофоретическая подвижность белков в ПААГ лежит в пределах 0,01—0,1 см/ч на 1 В/см. При напряженности поля 10—20 В/см этому соответствуют скорости миграции белков в диапазоне 0,1—2 см/ч. Таким образом, при рабочей длине геля 10 см за 5 ч электрофореза наиболее быстрые белки могут достигнуть конца геля, в то время как наименее подвижные продвинутся лишь на 0,5 см. Цифры эти — сугубо приближенные и приведены здесь лишь для общей ориентировки. В конкретных случаях возможны существенные отклонения от них. Например, если заранее известно, что разделяемые белки сильно различаются между собой по заряду или размерам, то можно вести электрофорез в условиях более высоких подвижностей и ), т. е. в более крупнопористых гелях, и тем сократить время фракционирования в 2—3 раза. [c.15]

Область с повышенной напряженностью поля можно создать в крупнопористом геле, полимеризованном в буфере с малоподвижными ионами (см. выше, вариант 2). Такой подход использован в системе ступенчатого электрофореза, рассмотренного ниже. Этого же можно добиться и путем растворения исходного препарата белка в том же рабочем буфере, но в 5—10 раз менее концентрированном (вариант 1). Нанесение препарата на гель в разбавленном рабочем буфере нашло широкое применение в силу простоты и достаточно хорошей эффективности этого приема. [c.45]

Один весьма успешный способ преодоления этой трудности заключается в отделении нужного фермента от других белков с помощью гель-электрофореза [100]. Образец фермента наносят на довольно крупнопористый гель и электрофорез продолжают до тех пор, пока фермент четко не отделится от всех сопутствующих примесей. После локализации положения фермента в геле последний разрезают и слой, содержащий фермент, растирают до получения тонкой суспензии, состоящей из полиакриламидного геля и фермента. Эту суспензию и используют затем для первой инъекции нескольких сотен микрограммов белка оказывается вполне достаточно. Иммуноглобулины, полученные таким способом, содержат до 10% антител к нужному ферменту. Остальные 90% — это относительно неспецифические иммуноглобулины, присутствующие в организме животного к моменту иммунизации. К 1 см агарозы можно присоединить десятки миллиграммов иммуноглобулина, [101]. При этом на 1 смз геля будет приходиться до 1 мг специфических антител. Но, поскольку молекулы антител присоединяются к адсорбенту таким образом, что это приводит в большинстве случаев к потере их способности связывать антиген, концентрация активных антител будет составлять, вероятно, лишь около 0,1 мг/см Если каждая молекула этих антител связывает одну молекулу антигена с близким значением молекулярной массы, то емкость такой колонки будет порядка 0,1 мг/см , это небольшая, но вполне достаточная емкость для очистки малых [c.174]

Для успешного электрофореза необходим канал , в котором происходит разделение. Он может представлять собой колонку (вертикальную), плоскую ванну или прямоугольный блок (горизонтальный), в которых движутся белки. Связь обоих концов этого канала с электродами осуществляется через большие резервуары с буфером. Необходима также система охлаждения, чтобы поддерживать постоянной температуру канала . Из-за того что в свободном растворе трудно поддерживать устойчивую границу, буфер в этом канале может быть смешан с инертным порошком или материалом в виде гранул, что позволяет снизить до минимума как гравитационную, так и диффузионную нестабильность. Простейшая система представляет собой горизонтальный блок. Сухой порошок крахмала, сефадекс 0-25 (не удерживающий белок) или порошок любого другого полимерного материала смешивают с буфером так, чтобы образовалась густая суспензия, которую вносят в прибор. Избыток буфера удаляют. Вместо суспензии можно использовать очень крупнопористый гель, например 2%-ный агар или агарозу. Концы геля соединяют с увлажняемой тканью или другим материалом, образующим контакт с наполненными буфером резервуарами, в которые помещены электроды (рис. 5.14). [c.217]

Прибор для диск-электрофореза показан на рис. 4.7. Он состоит из двух сосудов с буфером — верхнего и нижнего, соединенных, между собой рядом вертикальных цилиндрических стеклянных, трубок (рабочие трубки), содержащих гель (рабочий гель и гель-прокладку). В нижнем сосуде находится анод, а в верхнем — катод. Образцы наносят на поверхность столбиков геля при заполненном буфером нижнем сосуде, затем буфером заполняют и верхний сосуд, ставят на место крышку и включают ток. Буферные растворы подбирают таким образом, чтобы разделяемые вещества были в них. заряжены отрицательно. По мере их движения через гель вниз, к. аноду, происходит разделение, обусловленное различиями отношений заряда к массе. Диск-электрофорез называют еще прерывистым электрофорезом (в отличие от непрерывного, проточного). Это название отражает особенность метода, заключающуюся в использовании неоднородной ( прерывистой ) среды (гелей) и буферов разного состава и с разными значениями pH. Верхняя треть-столбика геля состоит из крупнопористого геля-прокладки, или концентрирующего геля, а нижняя — из рабочего, или разделяю-щего, геля с более мелкими порами. [c.131]

Выбор значения Т зависит от природы различия электрофоретических подвижностей белков в геле. Если сильно различаются размеры молекул, а отношение заряда к массе у них более или менее одинаково, то имеет смысл выбрать Т максимальным. Разделение в этом случае будет происходить только за счет трения о гель, причем тем эффективнее, чем больше Т, хотя при этом в связи с увеличением продолжительности электрофореза усилится диффузия белков. Если же компоненты анализируемой смеси имеют различные отношения заряда к массе, то может оказаться выгодным вести разделение в крупнопористом геле [c.15]

Персон и соавторы отделяли гель-фильтрацией гибрид ДНК— РНК от не включившейся в него РНК. В качестве низкомолекулярного партнера фигурировала суммарная РНК из клеток HeLa, зараженных аденовирусом. Ее гибридизовали с высокомолекулярной ДНК аденовируса. Естественно, что в этом случае для отделения РНК пришлось использовать весьма крупнопористый гель — сефарозу 2В. Колонка размером 0,9 X 20 см была уравновешена и элюировалась 0,05 IVi Трис-НС1, pH 7,9, содержавшим 0,5 1VI Li l, 0,5% ДДС-Na и 1 мМ ЭДТА. Препараты вносили прямо в гибриди- [c.144]

Диск-электрофорез обычно проводят в узких стеклянных трубках, содержащих два разнопористых геля, Б ходе электрофореза в верхнем относительно более крупнопористом геле происходит концентрирование смеси, а в нижнем мелкопористом — ее разделение. Верхний и нижний гели готовят на различных буферных растворах, которые в свою очередь отличаются от буфера в электродных сосудах. [c.148]

Колонку геля готовят точно так же, как и для щелочной системы анализа. Затем на ее верхнюю часть пипеткой наносят 0,2 мл раствора мономеров, предназначенного для приготовления крупнопористого геля. Еще выше осторожно наслаивают 5—8 мм разбавленного в8раз раствора Б . После этого трубки стелем 15—20мин освещают электрическими лампами мощностью 400—500 Вт на расстоянии 15—20 см до наступления полимеризации, о чем можно судить по появлению опалесценции геля. Жидкий слой сверху удаляют фильтровальной бумагой и вместо него наносят исследуемый раствор. В отличие от анализа в щелочной системе исследуемый раствор перед нанесением разводят в 8 раз разбавленным раствором Б . В остальном все элементы процедуры аналогичны щелочной системе анализа. [c.92]

Полученный таким путем ксерогель умеренно набухает в х. 1ороформе и бензоле и вполне пригоден для фракционирования, например, олигомеров стирола. Полимеризацию можно также проводить в суспензии при этом образуются сферические гранулы. Гель с низким содержанием бифункционального мономера (менее 0,25 мол.%) неудобен в обращении, поэтому приведенная выше методика непригодна для получения крупнопористых гелей. Такие гели получают полимеризацией концентрированного раствора этиленгликольдиметакрилата в изоамиловом спирте [28], Эти полимеры относительно слабо набухают в бензоле (90—150%), но тем не менее обладают высокой пористостью. Несмотря на отсутствие сферических гранул, они отличаются очень низким сопротивлением току жидкости даже в сверхдлинных колонках (до [c.42]

На слой разделяющего геля нанести 0,2 мл концентрирующего крупнопористого геля (7 %), который готовят смешиванием 1 объема Б (24 мл 1 н НС1, 2,99 г трис и 0,23 мл ТЕМЕД на [c.271]

Отметим еще одно преимущество использования агарозы для ИЭФ в пластинах. Благодаря крупнопористости гелей агарозы и, следовательно, легкости выхода из них белков для их идентификации можно использовать иммунофиксацию. Для этого на влажный гель агарозы после окончания ИЭФ накладывают на 12 ч лист фильтровальной бумаги, пропитанной антисывороткой. Выходящие из агарозы в бумагу антигены образуют в ней иммунопреципитаты, которые можно обнаружить одним из методов, подробно описанных в следующей части книги. С помощью такого приема недавно была продемонстрирована микрогетерогенность тироксин-связывающих глобулинов сыворотки человека [ВитеЦ е а ., 1980]. [c.45]

Ориентировочно о характере различия электрофоретических подвижностей двух белков в данных условиях разд ения можно судить в том случае, когда известны их молекулярные массы и изоэлектрические точки, а также содержаний в них ионогенных аминокислот. Чаще всего бывают, хотя бы/приблизительно, известны молекулярные массы. Если они различаются незначительно, то имеет смысл ориентироваться сначала на крупнопористый гель и попробовать поварьировать pH буфера. [c.16]

Кольцевые ДНК. Двунитевые ДНК форм I, П и П1. Вирусные и митохондриальные двунитевые ДНК, а также плазмиды бактерий могут иметь структуру замкнутого двунитевого кольца. Нативное состояние такого кольца — сверхскрученное . Кольцо в целом сворачивается в жгут , что сильно увеличивает его компактность (форма I). Если же хотя бы в одной из двух нитей кольца имеется единичный разрыв сахарофосфатной цепи, то жгут разворачивается и силами электростатического отталкивания фосфатных групп кольцо расправляется. Компактность молекулы становится меньше, наружные размеры увеличиваются (форма П). Форма I при электрофорезе всегда мигрирует быстрее, чем форма II. Что касается линейной двунитевой молекулы ДНК (форма III), то она может мигрировать быстрее или медленнее, чем сверхскрученное кольцо одинаковой с ней молекулярной массы, в зависимости от среднего размера пор геля. Для крупнопористого геля решающим фактором может оказаться компактность формы I, для мелких пор на первый план выступа- [c.123]

В качестве лидирующих красителей при электрофорезе нуклеиновых кислот используют бромфеноловый синий и ксиленцианол. Следует только иметь в виду, что в крупнопористых гелях агарозы малые фрагменты ДНК могут обгонять даже бромфеноловый синий. [c.126]

Концентрацию полиакриламида можно варьировать в широких пределах в зависимости от размеров фракционируемых молекул. Возможны два варианта изменение общего содержания акриламида и изменение концентрации соединения, образующего поперечные сшивки (Ы,М -метиленбисакриламида). Каждый из этих вариантов преследует приблизительно одну и ту же цель, так как при повышении концентрации одного из этих двух реагентов размеры пор уменьшаются, в результате чего перемещение более крупных молекул еще более замедляется. Для белков с очень большими размерами, вплоть до 10 дальтон, можно приготовить крупнопористый гель, содержащий 3—4% акриламида и 0,1% бисакриламида, хотя с ним довольно трудно работать. Для очень низкомолекулярных белков размерами около 10 дальтон можно применять гель, содержащий 15% акриламида и 1% (или меньше) бисакриламида. При высоком содержании соединения, образующего поперечные сшивки, гель становится мутным. Нормальным является соотношение, когда на [c.319]

Стеклянные пластины, одна из которых несколько длиннее другой (130x150 и 130x130 мм), отделяют друг от друга с помощью прокладок из органического стекла толщиной 1 мм и склеивают липкой лентой. В просвет между стеклянными пластинами заливают раствор мелкопористого полиакриламидного геля, а затем, после его полимеризации, заливают крупнопористый гель. В [c.58]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология