Бесклеточные системы

В случае использования эукариотических 80S рибосом для трансляции в бесклеточной системе все соответствующие белковые факторы должны быть также эукариотического происхождения. Это два фактора элонгации EF-1 и EF-2 (вместо EF-Тц, ЕР-Т и EF-G), многочисленный набор факторов инициации (eIF-1, eIF-2, eIF-3, eIF-4A, eIF-4B, eIF-4 , eIF-4D, eIF-4E, eIF-4F, eIF-5) и один высокомолекулярный фактор терминации (eRF). Для инициации в эукариотических системах требуется также АТФ. [c.58]

Важным условием для бесклеточной системы является ионная среда, и в первую очередь надлежащая концентрация ионов магния. Обычный интервал концентраций Mg2+, в котором работают рибосомы в бесклеточной системе, от 3 мМ до 20 мМ оптимум лежит где-то между этими значениями и зависит от рибосом и концентрации одновалентного катиона (К или NH4), а также от температуры инкубации. [c.58]

Основные факты, касающиеся трансляции и ее молекулярных механизмов, были получены и получаются в настоящее время на бесклеточных системах. [c.58]

Этот цикл у бактерий удается целиком осуществить в простой бесклеточной системе, состоящей из ДНК-матрицы и очищенной РНК-полимеразы, без каких бы то ни было дополнительных факторов, Эго не значит, что РНК-полимераз является единственным белком, участвующим в транскрипции. В ней могут участвовать и разнообразные регуляторные белки- Однако роль их вспомогательная они мешают или помогают РНК-полимеразе на тех или иных стадиях цикла транскрипции, которые она осуществляет и в их отсутствие. Поэтому изучение цикла транскрипции изолированной бактериальной РНК-полимеразой позволяет понять не только фер-.ментативные механизмы синтеза молекулы РНК, но, что еще важнее, дает ключ к пониманию механизмов регуляции транскрипции. [c.137]

Изменение характера экспрессии генов можно наблюдать в бесклеточных системах, компонентами которых являются собственно ген, энхансер и специфические регуляторные белки. Оказывается, что энхансер в зависимости от добавляемого белкового фактора может начать вести себя и как негативно действующий глушитель <англ. silen er) экспрессии гена. Негативное действие такого элемента, проявляется при связывании с тканеспецифичным трансдействующим белковым фактором. Подобные элементы с негативными эффектами были обнаружены, например, вблизи генов инсулина I и ач1)етопротеина крысы, экспрессия которых наблюдается соответственно в р-клетках поджелудочной железы и в печени, но отсутствует во многих других тканях. Негативное действие глушителей , как и в случае энхансеров, не зависит от положения и ориентации относительно сайта инициации транскрипции. [c.205]

Говоря о вирус-специфических репликационных белках, следует подчеркнуть, что во многих случаях в незараженной клетке имеются белки с аналогичной функцией. Причем в искусственных бесклеточных системах можно наблюдать, как клеточные ферменты работают на вирусной ДНК, а вирусные ферменты — на клеточной ДНК- Однако in vivo в зараженной вирусом клетке ситуация иная- Так, если вирус кодирует собственную ДНК-полимеразу (напри.мер, фаг Т4 нли вирус герпеса), то репродукцию такого вируса может обеспечить только вирусный фермент и этот вирусный фер.мент не катализирует синтез клеточной ДНК в зараженной клетке. Это кажущееся противоречие — высокая специфичность по отношению к матрице л vivo и низкая л w/ro — имеет [c.282]

Финалом этой истории было использование синтетических полинуклеотидов с регулярной нуклеотидной последовательностью в качестве матриц в бесклеточных системах синтеза полипептидов на рибосомах. Методы синтеза регулярных полинуклеотидов были разработаны Г. Хорана, и им же генетический код был прямо проверен путем использования их как матриц. В полном соответствии с кодом, использование поли(иС) в качестве матрицы дало полипептид, построенный из чередующихся серина и лейцина, а поли(иО) приводил к синтезу регулярного полипептидного сополимера с чередующимися валином и цистеином. Поли (AAG) кодировал синтез трех гомополимеров полилизина, полиаргинина и полиглютаминовой кислоты. [c.15]

Хорошим примером полицистронной мРНК является РНК малого РНК-содержащего бактериального вируса (фага) MS2. Фаг MS2 — сферический он имеет диаметр 2,5 нм и молекулярную массу 3,6 10 дальтон. Фаг построен из 180 субъединиц белка оболочки с молекулярной массой 14700 дальтон каждая, одной молекулы так называемого А-белка с молекулярной массой 38000 дальтон и одной молекулы РНК с молекулярной массой 10 дальтон. После попадания фага в клетку Е. соИ (а также в бесклеточной системе трансляции) эта РНК служит матрицей для белка оболочки, А-белка и субъединицы РНК-репликазы с молекулярной массой 62000 дальтон, которая в состав фага не входит. Схема расположения соответствующих цистронов вдоль цепи этой мРНК дана на рис. 6. Цепь начинается с G, имеющего трифосфат на своем 5 -гидроксиле. Далее следует длинная некодирующая нуклеотидная последовательность. Общая длина 5 -концевой некодирующей последовательности 129 остатков в ней встречаются триплеты AUG и GUG, которые, однако, не являются инициаторными. Первый инициаторный кодон, GUG, начинает кодирующую последовательность А-белка (А-цистрон). А-цистрон имеет длину 1179 остатков и заканчивается терминаторным кодоном UAG. Затем идет некодирующая вставка длиной 26 остатков. Следующая кодирующая последовательность начинается с AUG и имеет длину 390 остатков это —цистрон белка оболочки (С-цистрон). Он оканчивается терминаторным кодоном UAA, и за ним непосредственно следует второй терминаторный кодон UAG. Последовательность длиной 36 остатков отделяет С-цистрон от S-цистрона, кодирующего субъединицу РНК-синте-тазы. S-цистрон начинается с AUG, имеет длину 1635 остатков и заканчивается UAG. За ним через один остаток (т. е. не в фазе) имеется еще один терминаторный триплет UGA. З -концевая некодирующая последовательность имеет общую длину 174 остатка и заканчивается аденозином со свободной г/мс-гликольной группиров- [c.20]

Рибосома имеет собственное сродство к матричным полинуклеотидшу / Уже давно известно, что среди синтетических полирибонуклеотидов вакантная рибосома лучше всего связьшает полиуридиловую кислоту, на чем и было основано широкое применение поли(и) в качестве матрицы в бесклеточных системах трансляции. Возможно, что отсутствие стабильной вторичной и третичной структуры в поли(и) является существенным фактором ее хорошего связьшания с рибосомой. В случае природных мРНК имеются совершенно определенные предпочтительные места на полинуклеотиде, с которыми могут связьшаться вакантные рибосомы (см. гл. В.VI). В любом случае прочная сплошная двойная спираль вряд ли может служить местом присоединение вакантных рибосом. [c.136]

Хотя тетрациклины не действуют на эукариотические клетки из-за непроницаемости их мембран для антибиотика, в эукариотических бесклеточных системах они тоже оказываются сильными ингибиторами, подавляя связывание аминоацил-тРНК с 80S рибосомами. [c.166]

В положении нестрогого спаривания возможны, по-видимому, все типы противостояний, включая I G, G А, G G, U U, U С, С А, С и и С С. Этим объясняются те случаи, когда любая из изоакцептор-ных тРНК могла узнавать в бесклеточной системе любой из четырех кодонов данной кодоновой семьи (т. е. кодонов, имеющих общими два первых нуклеотида). [c.170]

Так как ложное кодирование очень сильно зависит от целого ряда как внешних, так и структурных факторов, то очевидно, что в бесклеточных системах его уровень может варьировать в чрезвычайно широких пределах. Поэтому важно оценить, каков естественный уровень ложного кодирования в нормальных живых клетках, не подвергаемых тем или иным экстремальным воздействиям и не содержащих мутационных нарушений белоксинтезирующего аппарата. Однако оценить это нелегко по ряду причин. Во-первых, на стадиях, предшествующих связыванию аминоацил-тРНК, тоже возможны ошибки, например, ложное ацилиро-вание тРНК оно будет завышать оцениваемый уровень ложного кодирования. Во-вторых, на стадиях после связывания аминоацил-тРНК и включения ложной аминокислоты в пептидную цепь возможна элиминация ложного продукта — либо путем аборта растущего пептида, либо путем переваривания окончательного неправильного белкового продукта. В-третьих, если готовый неправильный продукт обладает другими свойствами, чем правильный, то он может не встраиваться в те структуры, в которых мы его ищем, или не выделяться теми процедурами, которые мы используем для данного белка. Два последних обстоятельства будут занижать оцениваемый уровень ложного кодирования, и могут занижать его сильно. [c.172]

В бесклеточных системах обычно уровень ложного кодирования мно-IPO выше частота замен может достигать 10 2, а в пределах одной кодоно-Вой группы (Phe->Leu) даже 10 на кодон. Однако в специальных (Нонных условиях (низкий Mg2+, оптимизированные соотношения других компонентов) можно воспроизвести уровень ложного кодирования, Ьриближающийся к оценке 10 —ошибок на кодон. [c.173]

Было установлено, что при определенных условиях в бесклеточных системах транслокация может происходить также и в отсутствие факторов элонгации и ГТФ. Эта неэнзиматтеская транслокация идет гораздо медленнее, чем EF-G ОТР-катализируемая, но, тем не менее, дает в результате нормальное посттранслокационное состояние рибосомы, которое способно продолжать элонгацию. Следовательно, процесс транслокации является термодинамически спонтанным. Транслокационный механизм оказывается принципиально присущ самой рибосоме, а не привносится фактором элонгации. [c.203]

Об ингибировании элонгации сообщалось также в случае клеток, инфицированных вирусом осповакцины, и этот эффект оказалось возможным воспроизвести в бесклеточных системах in vitro добавлением вирусного нуклеопротеида. Это наводит на мысль о прямом действии вирусного компонента на какое-то звено элонгационного цикла. [c.214]

В соответствии с вышесказанным трансляция интактной MS2 РНК в бесклеточных системах, а также, по-видимому, и in vivo начинается с инициации синтеза белка оболочки. Трансляция С-цистрона приводит к тому, что рибосомы движутся вдоль него по направлению к S-цистрону и расплетают структуру РНК по мере своего продвижения. Это приводит к открыванию инициирующего района цистрона S. Таким образом, еще до окончания трансляции С-цистрона первой рибосомой и синтеза первой молекулы белка оболочки инициирующий район S-цистрона делается доступным, и происходит инициация синтеза субъединицы РНК-репликазы. [c.235]

Геминконтролируемая инициация трансляции в ретикулоцитах. Давно было известно, что синтез белка (главным образом, гемоглобина) в ретикулоцитах кролика и других млекопитающих, а также в лизатах ретику-лоцитов и ретикулоцитных бесклеточных системах требует присутствия гемина. В отсутствие гемина синтез белка быстро затухает. [c.259]

Ингибитор в активированном состоянии оказался обладающим ц АМФ-независимой протеинкиназной активностью, специфически фос-форилирующей а-субъединицу eIF-2 за счет АТФ. Именно эта активность и является ответственной за ингибирование (репрессию) инициации трансляции в клетках, лизатах, экстрактах и бесклеточных системах ретикулоцитов в отсутствие гемина. Киназная активность обратимого ингибитора подавляется гемином. Ингибитор, как уже отмечалось, способен также к автофосфорилированию, которое, возможно, играет какую-то роль в регуляции его активности. [c.260]

Молекулярная биология клетки Том5 (1987) -- [ c.191 ]

Биотехнология (1988) -- [ c.79 , c.83 ]

Химия биологически активных природных соединений (1970) -- [ c.482 ]

Биотехнология - принципы и применение (1988) -- [ c.79 , c.83 ]

Молекулярная биология клетки Т.3 Изд.2 (1994) -- [ c.270 ]

Молекулярная биология клетки Т.3 Изд.2 (1994) -- [ c.270 ]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология