Кинетический метод определения констант связывания

Величины констант диссоциации, рассчитанные по кинетическим данным для некоторых комплексов карбоангидразы с сульфамидами, изменяются от 2-10 для этонсзоламида до 2,6-10 для сульфаниламида и представлены в табл. 16.11. Исключительно низкие значения констант говорят о весьма высокой прочности связей в этих нековалентных комплексах. Эта особенность была использована для разработки удобного метода определения концентрации карбоангидразы титрованием ее растворов этокс-золамидом [103, 105, 112]. Как отмечалось выше, спектральные изменения при связывании сульфамидов и исследования с помощью Н-ацетазоламида свидетельствуют о непосредственном взаимодействии сульфамидов с ионами металла в активном центре [20, 21], причем координация, очеввдно, происходит за счет группы —SO2—NH2 [21, 111]. Это согласуется с результатами рентгеноструктурного анализа [22, 23] кристаллического комплекса карбоангидразы С человека с сульфамидом. Они показывают, что во внутреннюю координационную сферу цинка включена амин-ная группа сульфамида (разд. 6). По-видимому, в связывании участвуют анионная груп/пировка (—SO2— NH ) с одним протоном, замещенным на металл [30, 103]. В отсутствие конкуренции последнего величина рКа Для этой группировки колеблется от 7 до 10 (в зависимости от структуры R) [109, 115]. Некоторыми исследователями было обнаружено максимальное связывание при рН 7. В кислых и щелочных растворах прочность взаимодействия быстро падает [86, 115, 116]. Причиной распада комплекса в кислой области может являться уменьшение количества анионной формы ингибитора. [c.594]

Можно показать, как было сделано для процесса диссоциации в схеме (8.1), что при применении любого из трех вышеописанных экспериментальных методов определения кинетических констант диссоциации (резкое и многократное разбавление системы по достижении в ней состояния равновесия, удаление лигандов путем их связывания адсорбентами или разрушения, добавление больщих избытков агонистов лигандов) процесс диссоциации протекает необратимо и описывается соотношениями (10.81) — (10.83). Это позволяет определить константы k-i, k-2 путем соответствующей обработки зависимостей (10.81) — (10.83) в полулогарифмических координатах методами, описанными в главах 8 и 9. Данный метод определения наиболее часто используется на практике. [c.247]

Однако часто эти условия невыполнимы, тогда для определения кинетических констант процессов вида (10.1) —(Ю.2) используют следующий метод. Из зависимостей по равновесному связыванию определяют равновесные константы процесса комплексообразования Ка и Ка2- Далее одним из описанных (см. гл. 8) экспериментальных приемов определяют константы скорости- диссоциации k-i и k-2, после чего находят константы скорости ассоциации k я kz. [c.247]

Одними из самых важных характеристик процесса связывания лигандов с центрами комплексообразования являются равновесные константы ассоциации процесса Ка. Именно равновесные константы связывания служат одной из наиболее- простых, но при этом важнейших характеристик сродства лиганда к данному центру. овяйлваяия, его специфичности, являются одной из величин, характеризующих его фармакологическую активность. Более того, как было упомянуто, один из важней-щих методов определения кинетических жонстант ассоциации основан на. предварительном измерении равновесных констант связывания и кинетических констант диссоциации. Поэтому при изучении процессов комплексосибразования лигандов с центрами связывания больщое вии-мание уделяется методам определения равновесных констант связывания. Существенно, что многие из этих методов позволяют определять и общую концентрацию центров комплексообразования — ценной ко- - личественной характеристики систе- [c.200]

Выше был, подробно рассмотрен процесс комплексообразования одновалентного лиганда с одним типом, центров связывания и найдены. за всимости концентраций компонентов системы от времени, выраженные через кинетические константы ки k-i и постоянные параметры, связанные с общими и начальными концентрациями компонентов La, Qa, Lo, Qo, Во. Таким образом, знание кинетических констант, характеризующих процесс как таковой, и общих и начальных концентраций компонентов, характеризующих данные конкретные условия протекания процесса, позволяет полностью его описать. При изучении биохимических процессов общие и начальные концентрации компонентов часто могут быть определены аналитическими методами либо в условиях in vitro даже заданы извне. Поэтому основные трудности связаны с определением кинетических характеристик отдельных стадий процессов. [c.193]

Кинетические кривые, представляющие эти зависимости, обычно имеют сложную геометрическую форму. Для их эффективного исследования необходимо использовать новые методы анализа формы кривых (см. гл. 3 и 4). Методы классической кинетики, направленные в O HOBIIOM на определение кинетических параметров, которые отражают константы скорости (Vmax, Km, Ki и T. д.), дают только косвенную информацию о количестве участков связывания лигандов. В отличие от первых, методы анализа формы кривых направлены на определение степенных параметров уравнения скорости, что дает возможность непосредственной оценки количества участков связывания и вида модификатора. Это обстоятельство наиболее важно для расшифрования молекулярного механизма регуляции Na, К-АТФазной активности ионами Na+ и К+. [c.86]