Определение равновесных констант связывания

Э.ТИМ методом часто пользуются по той причине, что определять константу скорости к-1 существенно проще, чем к поскольку процесс диссоциации, как правило, протекает не столь быстро по сравнению с процессом ассоциации. Методы же по определению равновесной константы связывания достаточно хорошо разработаны и будут подробно изложены иже. [c.196]

КОНКУРЕНЦИЯ ДВУХ ОДНОВАЛЕНТНЫХ ЛИГАНДОВ ЗА ОДИН ЦЕНТР СВЯЗЫВАНИЯ. КОНКУРЕНТНЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАВНОВЕСНЫХ КОНСТАНТ. КОНКУРЕНТНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА [c.230]

Процессы связывания, протекающие по схеме (10.1) — (10.2), часто используются в двух аспектах а) для определения равновесных констант комплексообразования с помощью конкурентного вытеснения меченого лиганда изучаемым б) для аналитического определения концентраций лигандов конкурентным методом. Рассмотрим эти аспекты применения систем конкурентного связывания подробнее. [c.247]

Рис. 112. Комплексообразование двух одновалентных лигандов Li н Ьг с одним типом центров связывания. Определение равновесных констант Каг и Kal

Как было показано в 3.3, в ряде случаев определение равновесных констант комплексообразования прямыми методами затруднено или невозможно. Тогда используют конкурентные методы определения констант связывания. Рассмотрим некоторые из них. Во избежание возможной путаницы в дальнейшем будем обозначать индексом 1 все, что относится к лиганду с известной константой связывания, а индексом 2 — все, что относится к лиганду с определяемой константой. [c.424]

Таким образом, анализ результатов всех трех экспериментов позволяет сделать вывод, что процесс связывания прогестерона с прогестерон-связывающим глобулином описывается схемой (8.1). Подтверждением этого является и совпадение величины, определенной из равновесного эксперимента (рис. 91, а) — константы связывания Ка со значением константы, вычисленной из данных кинетических экспериментов Эти константы равны [c.205]

Однако часто эти условия невыполнимы, тогда для определения кинетических констант процессов вида (10.1) —(Ю.2) используют следующий метод. Из зависимостей по равновесному связыванию определяют равновесные константы процесса комплексообразования Ка и Ка2- Далее одним из описанных (см. гл. 8) экспериментальных приемов определяют константы скорости- диссоциации k-i и k-2, после чего находят константы скорости ассоциации k я kz. [c.247]

Для определения равновесных стехиометрических констант связывания процесса (12.1) —(12.2) можно воспользоваться подходом, подробно рассмотренным в главе 11. Суть подхода заключается в следующем путем экстраполяции концевых участков кривой связывания в координатах Скэтчарда к осям координат определяются соответствующие отрезки ОА, ОС, ОВ, ОЕ на этих осях и тангенсы углов наклона tg а, р конечных участков кривой (рис. 142). Аналогично тому, как сделано было выше для схемы (ПЛ) — (11.2), можно показать, что в случае протекания процесса [c.313]

Если реакция смещения равновесия протекает медленно, то реагирующие смеси можно заморозить и определить равновесные концентрации компонентов методами химического анализа. Экспериментально определение равновесных концентраций осуществляют выводом из сферы реакции компонентов путем их осаждения или связывания в малодиссоциированные соединения. При химико-аналитическом определении констант равновесия удобно пользоваться мечеными атомами (11). [c.190]

Таким образом, для практического осуществления описанного метода необходимо, прежде всего, установить наличие линейной зависимости между концентрацией определяемых непрямым методом ИФА антител и регистрируемым значением оптической плотности. Для этого готовят серии разведений исследуемой иммунной сыворотки и изучают их связывание в непрямом методе ИФА. Обычно эти зависимости имеют, вид кривых с насыщением. Для проведения эксперимента выбираются разведения антисыворотки, лежащие в линейном диапазоне кривой. Для установления равновесной константы диссоциации комплекса Аг-Ат концентрацию антигена варьируют в диапазоне от 10 до 10 М. На рис. 20 приведен график для определения Кд комплекса ПХ-Ат. Однако вычисленные этим методом значения констант диссоциации комплекса Ат- Аг являются эффективными, поскольку при выборе уравнения не учитывается влияние взаимодействия антител с антигеном, сорбированным на твердой фазе, на равновесие в растворе. [c.162]

Реакция, при которой катион тяжелого металла соединяется с анионом с образованием растворимого сложного аниона, обычно называется комплексо-образованием. Комплексообразование представляет собой обратимую равновесную реакцию, которая может быть охарактеризована определенной константой равновесия. Умягчение воды, т. е. связывание ионов Са "" и — одно из важнейших применений конденсированных фосфатов в качестве примера можно написать следующее уравнение для триполифосфата [c.214]

При установлении констант равновесного связывания по данным хроматографии с зональным элюированием весьма важно, чтобы емкость колонки и сродство подвижного компонента к иммобилизованному лиганду соответствовали друг другу, только тогда можно получить в течение разумных промежутков времени вполне четкие кривые элюирования. Получение четких кривых элюирования зависит от ряда параметров, таких, как размер шариков и пор матрицы, диаметр и длина колонки и скорость потока [11, 12]. Кроме того, удерживание подвижного компонента непосредственно зависит от количества лиганда, присоединенного к матрице [1, 3]. При постоянной скорости потока и постоянном объеме колонки зоны подвижного компонента, введенного на матрицу с меньшим количеством иммобилизованного лиганда, элюируются в виде более острых пиков при меньших объемах элюирования. Увеличение количества иммобилизованного лиганда приводит к более широким пикам и большим объемам элюирования. Для установления соответствующей концентрации иммобилизованного лиганда для данной серии экспериментов обычно прибегают к методу проб и ошибок. Концентрация присоединенного к твердому носителю лиганда может первоначально контролироваться путем введения в реакцию с активированным твердым носителем определенных количеств лиганда. Дальнейшим исследованием ряда препаратов матрицы с различной плотностью лиганда можно опреде- [c.225]

Одними из самых важных характеристик процесса связывания лигандов с центрами комплексообразования являются равновесные константы ассоциации процесса Ка. Именно равновесные константы связывания служат одной из наиболее- простых, но при этом важнейших характеристик сродства лиганда к данному центру. овяйлваяия, его специфичности, являются одной из величин, характеризующих его фармакологическую активность. Более того, как было упомянуто, один из важней-щих методов определения кинетических жонстант ассоциации основан на. предварительном измерении равновесных констант связывания и кинетических констант диссоциации. Поэтому при изучении процессов комплексосибразования лигандов с центрами связывания больщое вии-мание уделяется методам определения равновесных констант связывания. Существенно, что многие из этих методов позволяют определять и общую концентрацию центров комплексообразования — ценной ко- - личественной характеристики систе- [c.200]

Определение равновесных констант связывания. Для иахож-дения равновесных констант процесса специфического комплексообразования лигандов с центрами связывания при наличии в системе связывания неопецифического можно воспользоваться двумя подходами. Во-первых, методами, описанными выше, можно определить концентрацию специфически связанного лиганда и далее воопользоваться обычными методами определения равновесных констант связывания, рассмотренными выше. Во-вторых, для определения равновесных констант комплексообразования можно воспользоваться методом разложения кривой связывания на асимптоты, учитывая, что асимптота, отвечающая неспецифическому связыванию, определяется как JimR (см. выще и рис. 136). [c.298]

Достаточно щирокое применение нащел другой метод определения равновесных констант связывания, предложенный Диксоном в 1953 г. [c.425]

Рис. 109. Конкурентное связывание двух одновалентных лигандов Li и Lj с одним типом цент ров комплексообразования в условиях L2a>Qa. Зависимости в координатах Bip—Lip (а) н 1/Bip—1/Lip (б). 6, в — определение равновесных констант Kai и I ol

В ряде случаев прямое измерение константы ассоциации комплекса белок — органический лиганд невозможно либо вследствие недоступности меченого соединения, либо вследствие небольшого значения величины константы ассоциации. В этих случаях обычно используют методы определения констант связывания, основанные на вытеснении лиганда с Известной константой связывания исследуемым лигандом. Рассмотрим некоторые из этих методов. Во избежание возможной путаницы будем обозначать индексом 1 все, что относится к лиганду с известной константой, индексом 2 — все, что относится к лиганду с определяемой константой. Суше-ствующие конкурентные методы определения равновесных констант можно подразделить на два типа а) методы, основанные на ингибировании связывания ( вытеснении ) первого лиганда с постоянной концентрацией Lia возрастающими концентрациями второго лиганда Lia (см. рис. 108) б) методы, основанные на анализе равновесных кривых связывания первого лиганда в присутствии постоянной концентрации второго лиганда Ьга (см. рис. 109, ПО). Выбор метода зависит от условий эксперимента, доступности лигандов, поэтому трудно отдать предпочтение какому-либо одному из них. [c.248]

Рассмотрим теперь, как можно учесть неспецифическое связывание при определении равновесных констант комплексообразования конкурентными методами. Для примера остановимся на методе вытеснения двумя одновалентными лигандами меченого лиганда (с. 251) (Blondeau et al., 1978). В присутствии неспецифичеокого связывания (практически ненасыщаемого) имеем [c.298]

Определение кинетических констант комплексообразования Определение равновесных констант комплексообразования Практические рекомендации по исследованию процессов комплексо образования лигаадов с центрами связывания. .... [c.344]

Определение кинетических констант процесса (12.1) —(12.2) может быть проведено следующим образом. Сначала путем анализа процессов диссоциации лигандов, в условиях (12.26), (12.27), используя зависимости (12.30)—(12.32), определяют константы скорости k-, k-2 (для этого процесс диссоциации лигандов изучают в условиях резкого разбавления системы или устранения лиганда, см. выше). Далее из анализа данных по равновесному связыванию определяют стехиометрические константы ассоциации Каъ Ка2 см. НИЖб). ЕсЛИ НаЙДеНЫ константы k-i, k-2, Kal, Ка2, ТО, учитывая соотношения (12.48) и (12.49), нетрудно найти ki и кг [c.312]

На рис. 36 представлены результаты определения равновесного выхода HBF4, обозначенного через ср, от валовой моляльности HF в растворе (Мо) при стехиометриче-ском соотношении компонентов. При вычислении Мо не учитывалось связывание НЕ в комплексы и образование воды в результате реакции. При вычислении величин констант равновесия принималось, что HBF4 и HBF3OH полностью диссоциированы в растворе, а диссоциация НЕ полностью подавлена. Допустимость последнего предположения подтверждается простым расчетом. [c.443]

В литературе иногда можно встретить классификацию методов ИФА, основанную на том, находится ли определяемое соединение в избытке или недостатке по отношению к центрам связывания. Однако этот подход не однозначен, так как лимитирующим является не только соотношение между концентрациями компонентов реакционной системы, но и концентрациями и равновесной константой комплексообразования специфического иммунохимического комплекса. Поясним сказанное на примере. Если концентрация определяемого антигена [Аг]о = 10 М, а концентрация добавленных специфических антител [Ат]о=10 М, то при равновесной константе, равной 10 М , только 50% антигена (0,5-Ю" М) окажется связаннным в иммунохимический комплекс. При обратном соотношении компонентов ([Аг1о=10 М, [Ат]о=Ю М) и той же константе равновесия концентрация комплекса останется той же самой, а следовательно, можно провести ее прямое определение одним и тем же способом. Однако по такой классификации, несмотря на проведение анализа одним и тем же способом, следует отнести его к двум различный типам, что, очевидно, нецелесообразно. [c.80]

Сравнение графиков показывает, что чувствительность определения антигена зависит от константы связывания и улучшается с ее увеличением. За параметр, характеризующий возможность измерения данной концентрации антигена, удобно принимать отношение равновесных концентраций связавшегося с антителами меченого антигена в отсутствие и в присутствии определяемого антигена (В /[АтАг ]). Близкие к единице значения этого параметра [c.232]

В следующей простейшей модели равновесного связывания предполагается, что сушествуют два типа независимых мест связывания, число которых равно ю и 20 оснований, с константами связывания К иК2 соответственно. Уравнение (23.78) остается справедливым для каждого из типов мест связывания, и, если имеется некоторый способ определения числа связанных молекул лигандов Г, и >2 по отдельности, то можно найти константы К у, К2, Вю и В2о- многих случаях, однако, экспериментально удается определить лишь обшее число связанных молекул, й = + 2-С помощью формулы (23.78), записанной для каждого из типов мест связывания, можно получить выражение для > [c.364]

Реакцию низкомолекулярного гаптена с антителами можно оценить с помощью прямых реакций, сргди которых наибольшее применение получил метод равновесного диализа (см. гл. 12). Полученные в эксперименте данные позволяют рассчитать константу равновесия (Д) в системе гаптен-антитело (см. гл. 4 и 12). Если определять величины константы равновесия при реакции антител к определенному конъюгированному антигену с рядом сходных по строению гаптенов, можно оценить вклад каждого радикала в структуру детерминантной группы. При этом удобно сопоставлять сродство к антителу какого-то аналога детерминантной группы со сродством наиболее близкого к ней по строению гаптена ре-ференс-гаптен). Таким способом получают относительную величину константы связывания Кот) Дотн= = Кх/Кр.г, где Кх — константа связывания исследуемого аналога, Кр.г — константа связывания референс-гаптена. [c.24]

Мы не можем с уверенностью сказать, в чем причина более высокой эффективности уабаинсодержащего сорбента по сравнению с дигоксинсодержащим. Теоретически можно было бы ожидать более высокой эффективности от аффинной колонки, полученной на базе самого антигена (или гаптена), а не его-аналога, особенно такого, для которого константа связывания с антителами более чем в 10000 раз ниже, чем константа связывания антигена. Такое представление основано на предположении, что на колонке будет сорбироваться только избыток свободных меченых антител, не связавшихся с молекулами свободного антигена в тестируемом образце. При скорости потока через колонку 34 мкл/с время пребывания комплекса [анти-г,ен — антитело] в контакте с сорбентом составляет лишь 17 с. По сравнению с константой первого порядка скорости диссоциации такого комплекса, составляющей -- 2 10 с , это время сравнительно мало. (Константа связывания антител с дигоксином, определенная методом равновесного связывания, составляет 5 10 л-МОЛЬ . ) В настоящее время мы исследуем возможности применения аналогичного подхода для определения других антигенов. Это могло бы оказаться весьма удобным для создания систем диагностического тестирования антигенов, которые доступны лишь в очень ограниченных количествах или с трудом поддаются очистке, таких, как малодоступные белковые антигены типа полипептидных гормонов или раковых опухолевых маркеров. В подобных случаях для иммобилизации вместо чистого (или частично очищенного) антигена можно было бы использовать синтетический пептидный фрагмент, полученный с помощью автоматического пептидного синтеза или методов молекулярного клонирования. Такие фрагменты могли бы выступать в роли относительно недорогих аналогов антигена для получения аффинного сорбента. [c.253]

Для нахождения равновесных констант комплексообразования очень удобным является метод, основанный на определении отношения общих концентраций соединения с неизвестной константой связывания и соединения с известной константой связывания, при которых оба соединения приводят к одинакоюму (обычно 50%) уменьшению связывания данной концентрации меченого (индикаторного) лиганда (рис. 3.65). Фактически это означает определение для каждого из лигандов. [c.426]

Во-вторых, во всех остальных случаях каждая из равновесных концентраций Bip, Вгр зависит от всех параметров системы. При этом лиганды Li и L2 взаимно влияют на связывание, конкурируют друг с другом (рис. 108). Это дает возможность использовать процесс взаимодействия двух лигандов с одним центром связывания для конкурентного определения констант комплексообразования одного из лигандов (при условии, что константа ассоциации другого лиганда известна). Можно также определить концентрацию лиганда, если известны все остальные параметры или имеются калибровочные кривые. Однако необходимо отметить, что конкуренция между лигандами Li и L2 за центр связывания (см. соотношения (10.113)) проявляется только в том случае, если СагЬгр и 1-b/ aiLip соизмеримы (на рис. 108 это соответствует концентрациям Ьга в районе точки перегиба кривой), и отсутствует при /Са2Ь2а<1 (на рис. 108 — участок кривой с низкими концентрациями Ьга). Аналогично из выражения (10.114) можно подучить и условия конкурентного влияния лиганда Li на связывание лиганда Ьг. [c.242]

Проведение экспериментов по исследованию процесса комплексообразования лиганда (ов) с центром (ами) связывания в условиях равновесия. Полученные, данные целесообразно представить в координатах Скэтчарда и Хилла. Это позволяет а) установить наличие кооперативных взаимодействий в системе или двух (или более) независимых типов центров связывания б) учитывая результаты экспериментов 2 и 3, выбрать схему процесса комплексообразования в) определить далее значения равновесной (ых) констант (ы) ассоциации и общей (их) концентрации (ий) центров связывания с последующим вычислением констант скорости ассоциации и диссоциации, используя результаты экспериментов 2 и 3 г) сравнить полученную (ые) равновесную (ые) константу (ы) с соответствующей (ими) константой (ами), определенной (ыми) только из кинетических экспериментов 2 и 3. Совпадение значе-чий этих констант может служить одним из критериев правильности выбора схемы процесса. [c.315]

Если в ионообменной реакции RA-Ь В+RB + А один из ионов (или оба, но в различной степени) связывается в недиссоции-рованное соединение или выводится в третью фазу, равновесие оказывается сдвинутым в сторону удаления иона. Эффективная концентрация этого иона определяется одновременно двумя или несколькими реакциями, в которые рн вступает обмен ионов между фазами ионита и раствора с распределением, соответствующим положению конкурирующих ионов в лиотропном ряду и количественному составу системы образование педиссоциированиого соединения с определенной константой диссоциации образование новой фазы труднорастворимого соединения с определенной растворимостью и произведением растворимости и т. д. Степень связывания иона по конкурирующим реакциям обычно резко различна, и равновесные составы фаз определяются чаще всего одной реакцией, обусловливающей наиболее глубокий вывод иона из сферы реакции. Собственно ионообменная реакция в таких системах оказывается чаще всего наиболее слабым взаимодействием, так как величины коэффициентов обмена ионов (обычно в пределах 0,1—10) не могут заметно изменить распределения, вызываемого образованием прочных комплексов или недиссоциированных молекул с константами нестойкости или диссоциации менее 10 . Однако при слабом комплексообразо-вании или существенно неполном выводе иона в осадок стандартные величины коэффициентов обмена приобретают значимость. [c.52]