Сульфамиды, связывание с карбоангидразой

Исследование функциональных и физико-химических аспектов взаимодействия ингибиторов с активным центром карбоангидразы способствовало разработке новых методов изучения фермента. Кинетические, спектральные и рентгеноструктурные данные о взаимодействии карбоангидразы с ингибиторами двух главных типов (сульфамидами и небольшими анионами) свидетельствуют о том, что их ферментативное связывание осуществляется одним и тем же центром белка [21, 101, 103]. Имеется достаточно оснований считать, что главную роль в этом взаимодействии играет обычная координация ионами металлов, хотя реальная картина явлений ингибирования может включать и другие типы взаимодействий [23]. [c.586]

Изменение спектральных свойств под воздействием сульфамидов будет обсуждено в разд. 4. С помощью Н-ацетазоламида можно непосредственно показать, что для связывания этого сульфамида необходим ион металла (рис. 16.9, а) [21]. При концентрациях, меньших Ю М, ацетазоламид не связывается апоферментом, тогда каж Zn(II)-карбоангидраза присоединяет 1 моль ингибитора уже при концентрации последнего 5-10 М (рис. 16.9, а). Характерно, что подобный тип взаимодействия обнаружен только с цинковыми и кобальтовыми комплексами карбоангидразы—единственными активными разновидностями металлофермента (табл. 16.8). По-видимО му, только реакционноспособная конфигурация активного центра допускает возможность связывания сульфамидов [21]. [c.586]

Этот механизм объясняет отсутствие ингибирования слабо связывающимися анионами при высоких значениях pH [101], возвращение спектральной картины комплексов Со (II)-карбоангидразы с анионами или сульфамидами к типичным спектрам щелочной формы неингибированного фермента, наблюдаемое также при высоких значениях pH [101], и смещение рН-зависимости в щелочную область в присутствии анионов [101]. Все эти явления вызваны конкуренцией с 0Н , который при достаточно больших концентрациях вытесняет анионы и реактивирует фермент. Этот механизм согласуется и с кинетическими данными, свидетельствующими о том, что в месте связывания анионов находится группа, основная форма которой существенна для гидратации СОг, а кислая форма необходима для дегидратации бикарбоната [99, 110]. Инфракрасные спектры комплекса карбоангидразы с [c.614]

Манн и Кейлин [19] обнаружили сильное ингибирование фермента из эритроцитов сульфамидами. Это свойство — особенность карбоангидразы, так как больще ни один из известных ферментов не ингибируется этими соединениями так же специфично. Поскольку эти ингибиторы сыграли очень важную роль в физико-химических и энзимологическихисследованияхфермента, разд. 4 посвящен детальному обсуждению свойств сульфамидных комплексов карбоангидразы. Хотя по своей природе сульфамиды не являются агентами, связывающими металлы в комплекс, последние данные свидетельствуют о том, что в молекуле фермента центр связывания сульфамидов содержит ион цинка в качестве одной из координирующих групп. Металл взаимодействует с группой —ЗОгМНг [20-23]. [c.561]

Несмотря на то что все указанные выше ионы входят в активный центр фермента, только 2п(П)- и Со(II)-карбоангидразы обладают свойствами, необходимыми как для катализа гидратации СОг, так и для проявления эстеразной активности (табл. 16.8) [20, 21]. Отсутствие каталитических свойств у остальных металлоферментов может объясняться небольшими изменениями геометрии координационной сферы или неспособностью к присоединению или быстрому замещению лигандов [21]. Связывание сульфамидов также зависит от природы металла [20, 21], и неактивные метал-локарбоангидразы не взаимодействуют с этими ингибиторами (табл. 16.8 подробнее см. разд. 4 и 7). [c.578]

Величины констант диссоциации, рассчитанные по кинетическим данным для некоторых комплексов карбоангидразы с сульфамидами, изменяются от 2-10 для этонсзоламида до 2,6-10 для сульфаниламида и представлены в табл. 16.11. Исключительно низкие значения констант говорят о весьма высокой прочности связей в этих нековалентных комплексах. Эта особенность была использована для разработки удобного метода определения концентрации карбоангидразы титрованием ее растворов этокс-золамидом [103, 105, 112]. Как отмечалось выше, спектральные изменения при связывании сульфамидов и исследования с помощью Н-ацетазоламида свидетельствуют о непосредственном взаимодействии сульфамидов с ионами металла в активном центре [20, 21], причем координация, очеввдно, происходит за счет группы —SO2—NH2 [21, 111]. Это согласуется с результатами рентгеноструктурного анализа [22, 23] кристаллического комплекса карбоангидразы С человека с сульфамидом. Они показывают, что во внутреннюю координационную сферу цинка включена амин-ная группа сульфамида (разд. 6). По-видимому, в связывании участвуют анионная груп/пировка (—SO2— NH ) с одним протоном, замещенным на металл [30, 103]. В отсутствие конкуренции последнего величина рКа Для этой группировки колеблется от 7 до 10 (в зависимости от структуры R) [109, 115]. Некоторыми исследователями было обнаружено максимальное связывание при рН 7. В кислых и щелочных растворах прочность взаимодействия быстро падает [86, 115, 116]. Причиной распада комплекса в кислой области может являться уменьшение количества анионной формы ингибитора. [c.594]

Введением хромофоров в молекулу сульфамида можно вызвать появление серии спектральных линий, соответствующих электронным переходам в области активного центра. Многие сульфамиды обладают хромофорньими группировками, оптические свойства которых меняются после связывания с карбоангидразой [30, 102, 115, 120]. Но наиболее ярко эти эффекты проявляются при взаимодействии с оксинафталиновым производным [c.597]

Карбоангидраза быка образует сильно флуоресцирующий комплекс с 5-диметиламинопафталии-1-сульфамидом (ДНСА) [103]. Исследуя усиление флуоресценции лиганда и тушение ультрафиолетовой белковой флуоресценции, Чен и Кернохан [103] показали, что с одной молекулой фермента овязывается одна молекула флуоресцирующего сульфамида. Константа диссоциации этогО комплекса равна 2,5-10 М. Флуоресценция свободного сульфамида имеет пик испускания при 580 нм и квантовый выход 0,055. Соответствующие значения для связанного ингибитора — 468 нм и 0,84. Большое смещение максимума испускания в коротковолновую область можно объяснить сильной гидрофобной природой центра связывания, а также отрывом одного протона от сульфамидной /группы лиганда при присоединении к ферменту [103]. [c.599]

А. Согласно этим данным, остатки триптофана и центр связывания сульфамида находятся в глубине молекулы. Рентгеноструктурный анализ (разд. 6), выполненный, правда, на другом видовом варианте (карбоангидраза С человека), яривел к такому же заключению. Тем самым доказывается аналогичность структур этих двух форм фермента. [c.600]

Сульфамиды связываются с активным центром, координируясь у иона металла (разд. 4). Их способность к связыванию мало зависит от структуры группировок, присоединенных к сульфамиду. Поэтому удается довольно просто шести в карбоангидразу йминоксильные метки, привязывая их к сульфамиду. Одно из таких соединений (УП) синтезировали и использовали Мущак и Коулмен [133]. [c.605]

Спектр ЭПР этого соединения в растворе показан на рис. 16.18, Л, а спектры его эквимолярных комплексов с различными изоферментами карбоангидразы—на рис. 16.18, , В и Г. Связывание со всеми тремя формами фермента затормаживает свободный радикал. Заторможенность несколько больше у фермента быка, что согласуется и с большей прочностью связей сульфамидов. Сравнение этого спектра с расчетными данным Ицковича [126, 134] для заторможенных свободных радикалов приводит к величине времени корреляции (т) для связанного с ферментом быка иминоксила в 2-10- —4-10- с. Интересно, что для времени вращательной релаксации, рассчитанного для комплекса той же формы карбоангидразы с флуоресцирующим сульфамидом, Чен Кернохан [103] получили значения 2,89-10- с. [c.605]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология