Карбоангидраза быка

Определение С-концевой структуры молекулы основано на способности бромциана отщеплять от С-конца изоферментов карбоангидразы быка и человека пептиды, содержащие 19 или 20 остатков аминокислот [57—59]. Строение этих пептидов показано в табл. 16.6. При нумерации остатков предполагается, что 21-й аминокислотой во всех случаях является метионин. Это позволяет во всех трех последовательностях выделить наибольшее число гомологичных участков (отмеченных рамками в табл. 16.6). Карбоангидраза В человека при этом оказывается короче на одну С-конце-вую аминокислоту (лизин). Наблюдается также большое структурное сходство карбоангидразы С человека с изоферментами низших видов млекопитающих. Последнее согласуется с результатами физико-химических и кинетических исследований (разд. 2.3). [c.570]

Рис. 16.10. Дифференциальные ИК-спектры карбоангидразы быка в присутствии

Методами потенциометрического и спектрофотометрического титрования обеих форм карбоангидразы человека [69, 70] и изофермента В быка [71] были получены детальные кривые титрования в области ионизации гидроксильной группы тирозина. При кислотном титровании карбоангидразы В человека наблюдается скачок при pH 4,0—4,2, соответствующий поглощению 7 протонов на [c.571]

Карбоангидраза В быка имеет изоэлектрическую точку при pH 5,65 [71]. При титровании этого фермента кислотой также обнаруживаются 7 остатков гистидина, протонирование которых происходит в узком интервале около pH 4 и сопровождается значительной перестройкой конформации. При обратном титровании все [c.572]

Ведутся активные исследования первичной структуры изоферментов карбоангидразы быка и карбоангидраз В и С человека [49, 57—61]. Опубликованы предварительные результаты этой работы [49, 60, 61], однако к настоящему времени определены последовательности аминокислот только для некоторых фрагментов полипептидной цепи. Они представлены в конце данного раздела. [c.569]

Карбоангидраза быка образует сильно флуоресцирующий комплекс с 5-диметиламинопафталии-1-сульфамидом (ДНСА) [103]. Исследуя усиление флуоресценции лиганда и тушение ультрафиолетовой белковой флуоресценции, Чен и Кернохан [103] показали, что с одной молекулой фермента овязывается одна молекула флуоресцирующего сульфамида. Константа диссоциации этогО комплекса равна 2,5-10 М. Флуоресценция свободного сульфамида имеет пик испускания при 580 нм и квантовый выход 0,055. Соответствующие значения для связанного ингибитора — 468 нм и 0,84. Большое смещение максимума испускания в коротковолновую область можно объяснить сильной гидрофобной природой центра связывания, а также отрывом одного протона от сульфамидной /группы лиганда при присоединении к ферменту [103]. [c.599]

Упорядоченная структура растворителя, как следует из анализа свойств поглощения Со(11)-замещенного фермента в видимой области, необходима для каталитической функции и может оказаться существенной для каталитической эффективности различных изоферментов карбоангидразы. Величины Д я гидратации СОг ферментом быка [279, 280] возрастают с ростом pH, что указывает на величину рКа 6,9 каталитической группы, существенной для активности. Калифах [249] показал, что, в то время как в случае КАС наблюдается увеличение /г т с ростом pH, причем кажущаяся величина р/С этой зависимости близка к 7,0, в случае изофермента В величина / ат с увеличение.м pH непрерывно возрастает и при высоких значениях pH активность не запределива-ется. Интересно отметить, что pH однотипных спектральных изменений в видимой области для Со(И)-замещенных ферментов составляет 6,4 для фермента быка [257], 7,2 для КАС [261] и 8,1 для КАВ [281]. Витни [282] отмечал параллельное увеличение (эстеразной) активности Со(И)-замещенных КАВ и повышение концентрации соединений, поглощающих при 618—640 нм, в то же время Линдског [270] на основе исследования ингибиторов приходит к выводу, что активной формой фермента при гидратации СОг являются соединения, имеющие характерный двойной пик поглощения в области 618—640 нм. На основании корреляции структуры растворителя, свойств спектрального поглощения и каталитической эффективности изоферментов карбоангидразы можно заключить, что каталитическая способность фермента зависит от присутствия упорядоченных молекул воды в области активного центра. [c.111]

Карбоангидраза — первый металлофермент, в котором был обнаружен цинк. Данные о том, что в эритроцитах имеется белок, способный катализировать гидратацию — дегидратацию СОг, впервые были получены в лаборатории Рафтона [1—4]. Кейлин и Манн [5, 6] очистили фермент из эритроцитов быка и обнаружили в его препаратах 0,33% цинка. Молекулярная масса этого фермента около 30 000 [7—9]. В расчете на это значение, содержание цинка в белке колеблется от 0,92 до 1,52 г-атом/моль [5, 10, 11]. Было показано, что агенты, связывающие в комплекс металл (особенно анионы — цианид, сульфид, азид [4] и тиоцианат [12] и 2,3-димер-каптопропанол-1 [13]), являются сильными ингибиторами фермента. Эти данные указывали на важную роль ионов цинка для функционирования фермента из эритроцитов. [c.561]

Аминокислотный состав карбоангидраз эритроцитов представлен в табл. 16.2. Характерно наличие только одного остатка цистеина у большинства изоферментов и отсутствие этой аминокислоты в ферменте быка. Имеется один или два остатка метионина (см. ниже о расщеплении бромцианом) и небольшое число остатков тирозина и триптофана. С эволюционной точки зрения самой старой является карбоангидраза из эритроцитов акул. Фермент шестижаберной акулы имеет, вероятно, самую низкую для своей группы изоэлектрическую точку, равную 4,7, что согласуется с относительно высоким содержанием аспарагиновой и глутаминовой кислот (табл. 16.2). Единственный остаток цистеина карбоангидразы С человека, по-видимому, не участвует непосредственно в катализе. По данным рентгеноструктурного анализа, он расположен на расстоянии примерно 14 А от иона цинка [22, 23]. [c.565]

При выделении карбоангидразы из эритроцитов млекопитающих стало очевидным, что у каждого биологического вида можно обнаружить несколько электрофоретически различных белков с карбоангидразной активностью [34—40, 46]. У быка это ферменты А и В [34], у человека — карбоангидразы В и С [35—38]. Наиболее существенные отличия физико-химических свойств таких изоферментов определяются различием их аминокислотного состава (табл. 16.2) и последовательности аминокислот. А это в свою очередь проявляется в функциональных и структурных особенностях (см. ниже). Например, для изоферментов человека наблюдается значительная разница в уровне активности. При гидратации СОг карбоангидраза В проявляет удельную активность около 40 000 ед./мг белка, а тип С — примерно 1200000 ед./мг белка [47] (подробнее см. разд. 7). С физиологической точки зрения интересно, что содержание этих изоферментов в организме неодинаково — количество высокоактивной карбоангидразы С в 5—10 раз меньше, чем фермента типа В. Результатом этого является примерно равное распределение суммарной карбоангидразной активности между двумя изоферментами. [c.565]

Рис. 16.16. рН-Зависимость удельной скорости релаксации при малых частотах Со(II)-карбоангидраз В быка ) и человека (2). [c.601]

Спектр ЭПР этого соединения в растворе показан на рис. 16.18, Л, а спектры его эквимолярных комплексов с различными изоферментами карбоангидразы—на рис. 16.18, , В и Г. Связывание со всеми тремя формами фермента затормаживает свободный радикал. Заторможенность несколько больше у фермента быка, что согласуется и с большей прочностью связей сульфамидов. Сравнение этого спектра с расчетными данным Ицковича [126, 134] для заторможенных свободных радикалов приводит к величине времени корреляции (т) для связанного с ферментом быка иминоксила в 2-10- —4-10- с. Интересно, что для времени вращательной релаксации, рассчитанного для комплекса той же формы карбоангидразы с флуоресцирующим сульфамидом, Чен Кернохан [103] получили значения 2,89-10- с. [c.605]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология