Белки алкилирование электрофорезом

Между тем все выделенные фракции невосстановленных белков имеют сложный состав. Фракционирование единиц глютенинов после восстановления дисульфидных связей алкилирования позволяет отделить более простые фракции. Для этого в основном применяют методы электрофореза ДДС-Na-nAAF, электрофокусирование, ДДС-Na-nAAr совместно с электрофокусировкой [20, 92, 108], но с определенным успехом использовали также гель-фильтрацию и ионообменную хроматографию. [c.200]

Следует привести еще несколько примеров успешного применения гель-фильтрации в тонком слое. Линк [36] показал, что фракционирование в тонком слое можно проводить в присутствии 8М мочевины или 6,5 М хлоргидрата гуанидина. В этих условиях он сопоставил скорости миграции нативного и модифицированного (восстановленного и алкилированного) р-белка из спинномозговой жидкости. Совпадение скорост-ей миграции обоих образцов указывало на отсутствие в белке субъединиц с различным молекулярным весом. В сочетании с электрофорезом тонкослойную гель-фильтрацию применяли как удоб1у>1й метод контроля при выделении аминоацил-т-РНК-синтетаз [37]. При сопоставлении результатов анализа путем тонкослойной гель-фильтрации на G-200 двух фракций с валил-т-РНК-синтетазной активностью, но несколько различавшихся в функциональном отношении, оказалось, что обе фракции довольно близки по размерам молекул [38]. Радола [67] использовал тонкослойную гель-фильтрацию для решения ряда задач к ним относится анализ сывороточных белков животных и человека, растворимых белков культуры клеток млекопитающих in vitro, растворимых белков из листьев шпината. [c.266]

Наличие в белке более чем одной полипептидной цепи устанавливают, определяя его молекулярный вес в условиях, вызывающих денатурацию (например, в 1%-ном растворе додецилсульфата натрия). Для этого определяют молекулярный вес препарата до и после восстановления имеющихся в белке дисульфидных связей (меркаптоэтано-лом или дитиотреитолом). При этом рекомендуется закреплять образующиеся после восстановления 8Н-группы алкилированием с помощью иодоацетата, иодацетамида или этиленимина (фиг. 10). Для определения приблизительного молекулярного веса белка, а также для обнаружения его субъединиц или фрагментов (если вирусный белок состоит из нескольких цепей) — независимо от того, находятся ли они в свободном виде или организованы в более сложную структуру, образованную вторичными или дисульфидными связями (остатками цистина),— можно использовать метод электрофореза в полиакрил- [c.69]

Паркер и сотр. [72] в предварительных опытах показали, что восстановление и алкилирование дисульфидных связей в трансферрине по методу Крестфилда и сотр. [73] не вызывают диссоциации трансферрина на субъединицы. Это было доказано с помощью ультрацентрифугирования, методом седиментационного равновесия, с помощью гель-фильтрации на сефадексе Г-75, а также методом электрофореза на крахмальном геле в различных буферных системах (формиатный буфер pH 2,8, фосфатно-цитратный буфер pH 5,6 и боратный буфер pH 9,0) в присутствии мочевины. Кроме того, при определении N-концевых аминокислот в трансферрине динитрофениль-ным методом Сэнджера [74] и цианатным методом Старка и Смита [75] был обнаружен только один остаток валина при расчете на молекулярный вес 83 ООО, что согласуется с ранее опубликованной величиной молекулярного веса [76, 76а]. На основании описанных данных молекулу трансферрина можно представить в виде одной полипептидной цепи, содержащей примерно 750 аминокислот, и, следовательно, трансферрин является самым крупным из белков плазмы, который не был диссоциирован на субъединицы. [c.128]

Методы расп епления дисульфидных связей рассматриваются в разд. L5.1 и 2.2. Обп сприняты методы окисления надмуравьиной кислотой [41] и восстановления с последующим алкилированием [48]. Образующиеся полуцистинпептиды выделяют с помощью обычных методов химии белка, включающих гель-фильтрацию, хроматографию, электрофорез на бумаге, высокоэффективную хроматографию и др. [c.174]

Несмотря на жесткость описанной обработки, авторы метода рекомендуют при определении молекулярной массы малоизученного белка проверить полноту его денатурации. Для этой цели они предлагают обрабатывать контрольный препарат белка по более сложной прописи, гарантирующей его полную денатурацию (7 М гуанидинхлорид и 1,5%-ный -меркаптоэтанол с последующим алкилированием йодацетамидом). После этого формируют комплекс белка с ДДС-Na и сопостайляют Картины электрофореза белка, обработанного обычным способом, и контрольного препарата. [c.62]

Отмечено также, что некоторые, особенно высокомолекулярные, белки после первоначального полного их восстановления обработкой р-меркап-тоэтанолом и ДДС-Na в ходе электрофореза снова частично окисляются с образованием дисульфидных мостиков между полипептидными цепями, что приводит к размыванию полос и не-воспроизводимости результатов разделения. Рекомендуется восстановленное состояние белкового препарата закреплять путем его алкилирования по SH-группам обработкой йодацета-мидом. Для этого исходный препарат инкубируют с избытком этого реагента по отношению к количеству внесенного для восстановления белка р-меркаптоэтанола при 50° в течение 15 мин. От избытка йодацетамида и побочных продуктов реакции можно не избавляться, а наносить всю инкубационную смесь прямо на гель [Lane, 1978). [c.72]

Отмечено также, что некоторые, особенно высокомолекулярные, белки после первоначального полного их восстановления обработкой меркап-тоэтанолом и ДДС-Na в ходе электрофореза снова частично окисляются с образованием дисульфидных мостиков между полипептидными цепями, что приводит к размыванию полос и не-воспроизводимости результатов разделения. Рекомендуется восстановленное состояние белкового препарата закреплять путем его алкилирования ПО SH-группам обработкой йодацетамидом. Для этого исходный препарат инкубируют с избытком этого реагента по отношению к количеству внесенного для восстановления белка меркаптоэтанола [c.72]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология