Гель-фильтрация тонкослойная

При определении молекулярной массы с помощью гель-фильтрации [70, 73] применяют сефадексы различного типа (0-50, 0-100, 0-150, 0-200), агарозы (сефарозы 2В, 4В, 6В) или полиакриламиды (биогели Р-100, Р-150, Р-300). Процесс проводят как в хроматографических колонках, так и на тонкослойных пластинках. Принцип метода уже рассматривался в разд. 3.3. [c.361]

Методическое руководство по биохимии и иммунохимии белка. Рассмотрены теоретические основы методов и современная аппаратура для гель-фильтрации, бумажной, ионнообменной н тонкослойной хроматографии, в том числе методы количественного аминокислотного анализа с помощью автоматических анализаторов. Подробно описан анализ производных аминокислот методом газовой хроматографии. Книга хорошо иллюстрирована и снабжена подробной библиографией. [c.4]

Для качественного и количественного определения аминокислот используют гель-фильтрацию, бумажную, тонкослойную, ионообменную и газовую (для сложных эфиров) хроматографию. Эти методы очень важны для установления последовательности аминокислот в пептидах и белках. [c.345]

Для разделения полисахаридов может быть использована бумажная [34] и тонкослойная [35] хроматография, однако основами методами являются колоночные гель-фильтрация [36] и [c.223]

Принцип метода. Метод представляет собой комбинацию фракционирования исследуемого белка при помощи тонкослойной гель-фильтрации с иммунодиффузионным анализом в геле. [c.152]

Тонкослойная гель-фильтрация. На стеклянную пластинку размером 8 х 20 см наносят слой сефадекса 0-100 или 0-200 в [c.153]

Б. ТОНКОСЛОЙНАЯ ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ [c.238]

Движение подвижной фазы в тонкослойной хроматографии может быть ступенчатым, прерывным или непрерывным. Тонкослойную хроматографию можно комбинировать с тонкослойным электрофорезом, тонкослойным изоэлектрическим фокусированием, тонкослойной гель-фильтрацией и т. д. [c.6]

Среди методов, используемых для аналитического и препаративного разделения пуринов, следует отметить бумажную, колоночную (иногда на субстратах, пропитанных солями меди и серебра), газожидкостную, ионообменную, тонкослойную и высокоэффективную жидкостную хроматографию, а также электрофорез на бумаге и гель-фильтрацию на сефадексе G-10. [c.595]

С помощью гель-фильтрации на обычной колонке можно фракционировать вещества в количестве от долей миллиграмма до сотен граммов. Этот метод применяется даже в промышленных масштабах. При гель-фильтрации на микроуровне вполне применимы приемы тонкослойной хроматографии. [c.256]

Для тонкослойной гель-фильтрации слой носителя готовят из самых мелких гранул геля. Из препаратов, имеющихся в продаже, применяются гели декстрана марки сефадекс сверхтонкий или полиакриламидные биогели марки —400 меш . В описанных в литературе методиках тонкослойной гель-хроматографии в основном [c.238]

До настоящего времени гель-фильтрация в тонком слое находила применение главным образом при разделении белков. Разработаны модификации метода, сочетающие гель-фильтрацию с электрофорезом и иммунной преципитацией. Настоящая глава посвящена методическим аспектам тонкослойной гель-фильтрации, некоторым приложениям метода, а также указанным модификациям. Большое внимание, уделяемое разделению белков, отражается и в подборе конкретных примеров. Однако это не означает, что область применения метода ограничивается этой группой веществ. [c.256]

Рис. 1. Прибор для тонкослойной гель-фильтрации.

Тонкослойная гель-фильтрация в биохимии белков [c.263]

В последнее время появились сообщения о применении тонкослойной гель-фильтрации для изучения протеинурии. Г ель-фильтрацией на сефадексе 0-75 Дэвис и сотр. [28] показали, что [c.265]

Рис. 3. Тонкослойная гель-фильтрация сыворотки человека на сефадексе

При сопоставлении образцов свежего молозива и выделенных из него JgA оказалось, что JgA идентичны по величине молекул. Это послужило серьезным доводом в пользу того, что большие размеры JgA молозива нельзя объяснить полимеризацией в процессе выделения. JgA молозива и большинства других секретов содержит дополнительный секреторный компонент, отсутствующий в сывороточном JgA. Гель-фильтрацией в тонком слое сефадекса G-150 было показано, что он по своим размерам примерно соответствует димеру легких цепей иммуноглобулинов [35]. При изучении белков молозива свиньи Портер и сотр. [70] использовали тонкослойную гель-фильтрацию на сефадексе G-200 для оценки изменений в составе белков в первые четыре недели лактации. [c.266]

Для получения достоверных результатов рекомендуется вести гель-фильтрацию в присутствии денатурирующих агентов, т. е. в концентрированном растворе хлоргидрата гуанидина (см. [69]). Эта методика кажется довольно перспективной как в обычном (колоночном), так и в тонкослойном варианте гель-фильтрации. [c.268]

Рис. 9. Фракционирование сыворотки человека тонкослойной гель-фильтрацией на сефадексе 0-200 с последующим электрофорезом в геле агарозы, содержащем антисыворотку к а-липопротеину. Направление гель-фильтрации указано стрелкой.

Количественное определение а-аминокислот возможно титрованием по Сёренсену или же взаимодействием с азотистой кислотой по Ван-Слайку. Различные а-аминокислоты могут быть разделены методами бумажной, тонкослойной хроматографии, колоночной хроматографии на ионообменных смолах, гель-фильтрации или ионофореза. [c.503]

Приведенные примеры ясно показывают, что тонкослойная гель-фильтрация в сочетании с иммунной преципитацией является простым и удобным методом, который может дополнить иммуноэлектрофорез при идентификации белков в биологических жидкостях или при выделении белков. В случае необходимости чувствительность и разрешение метода можно повысить, выполняя электрофорез после тонкослойной гель-фильтрации в геле агарозы, содержащем антитела. [c.275]

В основе хроматографического процесса лежит перенос (обмен) вещества между подвижной и неподвижной фазами. В различных вариантах тонкослойной хроматографии этот обмен осуществляется по различным механизмам, которые определяют характер данного вида тонкослойной хроматографии адсорбционной, распределительной, ионообменной, молекулярно-ситовой (гель-фильтрация). Чаще всего в реальных случаях тонкослойной хроматографии действует несколько механизмов, например, вследствие использования активных твердых носителей реализуется адсорбционно-распределительный процесс, описываемый уравнением (14) [c.204]

В зависимости от состава и свойств подвижной и неподвижной фаз, от типа взаимодействия между ними и компонентами разделяемой смеси, т. е. в зависимости от механизма процесса, различают несколько видов хроматографии адсорбционную, распределительную, комплексообразовательную, ионообменную, осадочную, гель-фильтрацию. Имеются тонкослойные варианты практически всех видов хроматографии. [c.14]

Наиболее эффективным и широко применяемым методом фракционирования сложных смесей липидов является хроматография. Главную роль при аналитическом фракционировании играет адсорбционная хроматография в тонком слое сорбента. Этот метод также применяется в препаративных целях, когда разделению подвергается небольшое количество липидов (50—300 мг). Если масса липидов превышает 300 мг, используют колоночную хроматографию, хотя по разделяющей способности и времени разделения этот метод часто уступает тонкослойной и газовой хроматографии. Однократного хроматографирования обычно бывает недостаточно для выделения индивидуальных веществ, в связи с этим полученные фракции подвергают препаративной тонкослойной хроматографии или колоночной хроматографии другого типа. При колоночрюй хроматографии липидов используют не только принцип адсорбции, но и принцип распределения между двумя несмеши-вающимися жидкостями, гель-фильтрации, ионного обмена. [c.69]

Тонкослойный вариант гель-фильтрации был предложен Детер-маном [6], а также Иоханссоном и Римо [11 ] и оказался весьма полезным для микроанализа и быстрого сравнительного анализа нескольких образцов исследуемого материала. Эндрюс [1 ], а позднее Моррис [12] применили тонкослойную гель-фильтрацию для определения молекулярного веса белков на основе установленной ими линейной зависимости между логарифмом молекулярного веса данного белка и расстоянием, пройденным им в слое данного носителя за определенный помежуток времени. В соответствии с этим можно ориентировочно определять молекулярные веса неизвестных белков, если одновременно проводить гель-фильтрацию стандартных белков известного молекулярного веса. Когда исследователь располагает достаточно чувствительными методами обнаружения белка в слое носителя, для определения молекулярного веса достаточно всего лишь нескольких микрограмм исследуемого материала. При определении молекулярного веса белков гель-фильтрацией в тонком слое следует иметь в виду, что подвижность данного белка при хроматографии в гель зависит не только от молекулярного веса, но и от формы его молекул. Поэтому определение молекулярного веса с помощью гель-хроматографии правомерно лишь в том случае, когда форма молекул исследуемого белка незначительно отличается от < рмы молекул стандартных белков, используемых для калибровки. [c.238]

Наиболее часто тонкослойную хроматографию используют для определения молекулярной массы белков и белковых соединений. Показано [193, 194], что при помощи тонкослойной гель-фильтрации можно проводить приблизительную оценку молекулярной массы белков, используя сефадексы 0-75 и 0-200. Объем элюирующего буферного раствора находится в линейной зависимости от логарифма молекулярной массы белка [195]. [c.117]

Наиболее подходящая толщина слоя носителя — 0,5 мм. Для нанесения носителя на пластинки могут быть использованы описанные выше приборы, позволяющие получать слой разной толщины. Если суспензию носителя раскатывать стеклянной палочкой, на обоих концах которой наклеено несколько витков изоляционной ленты, также образуется достаточно ровный слой. Свежеприготовленные пластинки в течение 20—25 мин подсушивают на воздухе. Их можно довольно долго хранить во влажной камере, если исключена возможность бактериального роста. При нисходящей тонкослойной гель-фильтрации пластинку располагают в камере под углом 10—15° Как правило, гель-фильтрацию проводят в водных растворах, поэтому хроматографическая камера может быть изготовлена из пластмассы. Она состоит из кюветы для буферного раствора, рамки, поддерживающей пластинку под соответствующим углом, и крышки. Подача буферного раствора на пластинку осуществляется с помощью фитиля из фильтровальной бумаги. В качестве маркеров удобно использовать окрашенные высокомолекулярные вещества (например, меченные флуоресцеином ферритин или 7-глобулин), которые не задерживаются частицами геля. Гель-фильтрацию проводят до тех пор, пока маркер не пройдет по крайней мере 10 см от линии старта. После этого пластинку извлекают из рамки и покрывают слой носителя листом фильтровальной бумаги (например, Шляйхер-Шуль 2043 или ватман 3 ММ), вырезанным по размеру пластинки. Некоторые исследователи рекомендуют применять в этом случае лист сухой фильтровальной бумаги. В нашей лаборатории используется смоченная и тщательно отжатая фильтровальная бумага, так как с ее помощью легче прикрыть слой носителя без образования под бумагой пузырьков воздуха. После этого бумагу снимают (иногда вместе с частичками геля), высушивают при температуре около 120°С и окрашивают красителями, выявляющими белок, или реактивом Паули. Наряду с другими красителями можно воспользоваться, например, амидовым черным ЮВ, кислым фуксином и т. п. Во время отмывания несвязавшегося красителя частички геля отделяются от бумаги, и после высушивания она может быть использована для документации. [c.239]

Комбинированное использование тонкослойной гель-фильтрации с электрофорезом или иммунодиффузией до настоящего времени представляет собой один из наиболее тонких методов микроанализа белков. Хансон и др. [10] разработали метод двумерного разделения, используемый для анализа белков. На первом этапе белки подвергают гель-фильтрации в тонком слое сефадекса G-200 или G-100, а на втором — электрофорезу. Они предложили прибор, в котором хроматографическую пластинку можно закреплять под углом для гель-фильтрации и горизонтально для электрофореза. В описанных экспериментах использовали стеклянные пластинки размером 30 x 30 см и толщиной 1 мм, на которые наносили слой геля сефадекса толщиной 0,5 мм. Для набухания сефадекс оставляли в 0,05 М вероналовом буферном растворе pH 8,6. Сначала проводили гель-фильтрацию, а затем в направлении, перпендикулярном первому, в течение 3 ч вели электрофорез при градиенте напряжения 10 В/см. Этот метод весьма успешно был применен для анализа сывороток крови человека, спинномозговой жидкости и гормона роста. [c.240]

Избирательность различных материалов, используемых для гель-фильтрации, позволила использовать их в других методах разделения. Так, гели сефадексов применяются в адсорбционных методах, тонкослойной и распределительной хроматографии, а также в качестве носителя при зонном электрофорезе. Сефадексы с ионообменными свойствами (диэтил-, аминоэтил-, карбоксиметил-, сульфоэтнлпроизводные декстранового полимера) обладают одновременно преимуществами ионообменных смол и материалов на основе целлюлозы. [c.478]

Одним из основных факторов, влияющих на хроматографию сложных гликозидов, является объемный агликон, поэтому, кроме хроматографии, в системе жидкая фаза—жидкая фаза для их разделения применяют также гель-проникающую хроматографию (табл. 22.12). Из коры и листьев Populus tremula гель-фильтрацией на сефадексе С-25 и LH-20 с применением воды в качестве подвижной фазы были выделены сахароза, о-глюкоза и их фенольные гликозиды [143, 144]. Однако разделение продуктов синтеза, например Кёнигса—Кнорра, обычно проводят до удаления защитных групп методом хроматографии в системе жидкая фаза—твердая фаза. Систему растворителей обычно выбирают по результатам тонкослойной хроматографии, которую также применяют для детектирования. Примеры приведены в табл. 22.12. [c.108]

Гель-фильтрация на пластинках не требует какого-либо дорогостоящего оборудования. Правда, в этом случае не пригодна и обычная аппаратура для тонкослойной хроматографии. Простая легко изготовляемая модель, напоминающая прибор, описанный Детерманом [10], приведена на рис. 1. По краям вдоль пластинки закреплены два пластиковых стержня (толщина 0,5 см), на которых фиксируется стеклянная покровная пластинка. [c.258]

Гель фильтрация в тонком слое применяется преимущественно при исследовании белков и гораздо реже в других областях биохимии. Гроссман и Вагнер [23] использовали тонкослойную гель-фильтрацию на сефадексе 0-25 для идентификации компонентов нитросинего тетразолийхлорида, применяющегося обычно для гистохимических целей. Стикланд [24] тонкослойной хроматографией на дауэксе-1 и сефадексе 0-25 удалял из образцов полисахариды и флуоресцирующие примеси, которые обычно интерферируют при фракционировании 5-рибонуклеотидов в тонком слое ОЕАЕ-целлюлозы. Возможность разделения низкомолекулярных соединений в тонком слое сефадекса 0-10 и 0-15 вообще почти не исследовалась. Зюдвиг и сотр. [68] показали, что разделение различных антибиотиков на сефадексе 0-15 зависит от их адсорбции на геле. Не сделано никаких попыток использовать в тонкослойной хроматографии менее гидрофильные гели, например сефадекс ЬН-20. [c.263]

При исследовании компонентов моноклонального иммуноглобулина Гоббс [15] применил тонкослойную гель-фильтрацию сыворотки в сочетании с зональным электрофорезом и иммуноэлектрофорезом. Такое сочетание эффекта молекулярных сит и иммунной преципитации позволило обнаружить очень интересный компонент иммуноглобулина, представляющий собой половину молекулы иммуноглобулина О [26]. Парвес [27] предложил применять гель-фильтрацию в тонком слое для диагностики болезни тяжелых цепей , характеризующейся присутствием в сыворотке и моче больных аномального белка, напоминающего тяжелую полипептидную цепь иммуноглобулина О (или А). Этот пример приведен на рис. 3. [c.264]

Следует привести еще несколько примеров успешного применения гель-фильтрации в тонком слое. Линк [36] показал, что фракционирование в тонком слое можно проводить в присутствии 8М мочевины или 6,5 М хлоргидрата гуанидина. В этих условиях он сопоставил скорости миграции нативного и модифицированного (восстановленного и алкилированного) р-белка из спинномозговой жидкости. Совпадение скорост-ей миграции обоих образцов указывало на отсутствие в белке субъединиц с различным молекулярным весом. В сочетании с электрофорезом тонкослойную гель-фильтрацию применяли как удоб1у>1й метод контроля при выделении аминоацил-т-РНК-синтетаз [37]. При сопоставлении результатов анализа путем тонкослойной гель-фильтрации на G-200 двух фракций с валил-т-РНК-синтетазной активностью, но несколько различавшихся в функциональном отношении, оказалось, что обе фракции довольно близки по размерам молекул [38]. Радола [67] использовал тонкослойную гель-фильтрацию для решения ряда задач к ним относится анализ сывороточных белков животных и человека, растворимых белков культуры клеток млекопитающих in vitro, растворимых белков из листьев шпината. [c.266]

К настоящему времени накоплен определенный опыт работы на сефадексах 0-25, 0-200, но совершенно нет данных относительно использования 0-10 и 0-15. Ряд экспериментов на полиакриламидных гелях выполнены Радолой [66, 67]. Так, он показал, что на био-геле Р-300 достигается лучшее разделение фер-ритина, чем на сефадексе 0-200. Особенно интересно расширить область применения тонкослойной гель-фильтрации путем освоения гелей агарозы. В этом случае удалось бы фракционировать вещества с молекулярным весом до 1 000 000 и выше. Предварительные опыты с 4—10%-ной (вес/объем) сферической агарозой показали, что такая методика вполне осуществима [45]. Действительно на геле агарозы были получены очень четкие зоны, к тому же оказалось, что при высыхании на пластинке агароза дает более равномерную пленку, чем сефадексы. [c.268]

В то время как обычный электрофорез белков в тонком слое сефадекса, по-видимому, не представляет особого интереса, сочетание тонкослойной гель-фильтрации с последующим электрофорезом существенно расширяет возможности метода, поскольку наряду с более высоким разрешением здесь удается провести электрофоретическую идентификацию разделяемых компонентов. Методика двумерного фракционирования белков была разработана Иоханссоном и Римо [49] и подробно изложена в работе Хансона и сотр. [14]. Согласно этой методике, первой стадией разделения является гель-фильтрация в слое сефадекса (0-200 или 0-100) толщиной 0,5 мм на пластинках размером 30-30 см. Затем в перпендикулярном направлении в течение 3—4 ч ведут электрофорез при градиенте напряжения 10 В/см. В качестве электролита используют 0,05 М вероналовый буфер с pH 8,6. При электрофорезе пластинку необходимо охлаждать. Относительно простой и удобный прибор показан на рис. 5. [c.269]

Сочетание тонкослойных электрофореза и гель-фильтрации служит удобным методом исследования труднодоступных объектов, поскольку таким способом можно анализировать образцы, содержащие 10—50 мкг белка. При анализе этим методом лио-филизованные препараты гормона роста человека [50] оказались явно гетерогенными (рис. 6). Портер и сотр. [73] применяли двухмерное разделение в тонком слое сефадекса 0-150 при исследовании связывания гепарина белками плазмы было [c.269]

Применяемые на практике гели обычно подразделяют на мягкие, полужесткие и жесткие. Мягкими гелями являются высокомолекулярные органические соединения с незначительным число поперечных связей. Фактор емкости, равный отношению объема растворителя внутри геля к его объему вне геля, у них равен 3. При набухании они значительно увеличивают собственный объем. Это сефадексы или декстрано-вые гели, агарочные гели, крахмал и др. Они применяются для разделения смесей низкомолекулярных веществ, часто в тонкослойном варианте. Хроматографирование на мягких гелях называют гель-фильтрацией. [c.351]

Большинство ранних хроматографических разделений проводили на колонках с использованием подходящих сорбентов, но на некоторое время колоночная хроматография была вытеснена методами бумажной, тонкослойной и газожидкостной хроматографии (ГЖХ), которые обладали большей эффективностью и разрешающей способностью. Методом колоночной хроматографии проводили лишь препаративные разделения. Однако растущее использование ионного обмена и гель-фильтрации, а также бурное развитие высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) вновь сделали колоночную хроматографию одним из важнейших методов. [c.10]

Те же авторы [359] проводили на сефадексах 0-100 и 0-200 двумерное разделение соединений, входящих в состав сыворотки крови человека. При этом в одном направлении проводили разделение методом гель-фильтрации, а в перпендикулярном направлении — разделение методом электрофореза. Моррис [360, 361] разделял на сефадексах 0-100 и 0-200 белки с молекулярной массой до 180 000. Он кондиционировал сефадекс в течение 48 ч, а затем выдерживал пластинки в про-явительной камере 18 ч для достижения равновесия. В 1962 г. Доун и Краузе [357] применили сефадекс для тонкослойного электрофореза белков. Сефадекс 0-50 ( тонкий ) смешивали с избытком буферного раствора (1 7,5) и выдерживали в нем 24 ч, после чего буферный раствор отфильтровывали и полученный гель, который был пластичным, но не жидким, переносили на стеклянные пластинки, снабженные бортиками. Фей-зелла и сотр. [362] описали разделение белков на сефадексах 0-25, 0-100 и 0-200. Сефадекс выдерживали при перемешивании 30 мин в подходящем буферном растворе, затем давали смеси отстояться и сливали жидкость. Эту операцию повторяли пять-шесть раз, с тем чтобы общее время контакта с буферным раствором было не менее 48 ч для сефадекса 0-25 и не менее 72 ч для сефадексов 0-100 и 0-200. Вендрили и сотр. [363] увеличивали твердость слоев сефадекса для электрофореза, добавляя к ним агарозу. Для этого 1,25 г агарозы растворяли в 65 мл буферного раствора и осторожно добавляли 4 г сефадекса 0-200, 5 г сефадекса 0-100 или 6,5 г сефадекса 0-75, предварительно приведенных в равновесие с буферным раствором. [c.80]

Этот вариант ТСХ, широко применяемый в бумажной хроматографии, в сущности можно рассматривать как один из способов многократного или ступенчатого элюирования в двумерном пространстве. Однако двумерная хроматография более универсальна, чем оба эти метода. Первыми двумерное элюирование в ТСХ применили Кирхнер и сотр. [57]. Согласно разработанному ими методу, пробу наносят на угол квадратной хроматографической пластинки и элюируют обычным способом, после этого извлекают пластинку из камеры, дают растворителю испариться и помещают в другой растворитель таким образом, чтобы элюирование шло в направлении, перпендикулярном первому. Следует обратить внимание на то, чтобы линия пятен разделенных при первом элюировании веществ после поворота пластинки на 90° не оказалась ниже уровня второго элюента. Данный метод позволяет модифицировать адсорбент перед вторым элюированием. Изучая разделение мононенасыщенных жирных кислот, Бергельсон и сотр. [124] проводили первое элюирование на силикагеле, пропитанном додеканом, а перед вторым элюированием в перпендикулярном направлении дополнительно пропитывали слой адсорбента нитратом серебра. Иоханссон и Раймо [125] сочетали тонкослойную гель-фильтрацию на [c.151]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология