также Гель-фильтрация

При гель-фильтрации раствор, содержащий разделяемые вещества, пропускают через колонку, заполненную зернами набухшего полимера. Вещества, молекулы которых имеют большой размер и не могут проникать внутрь этих зерен, выходят из колонки вместе с растворителем. Меньшие по размеру молекулы других веществ диффундируют в набухшие зерна и задерживаются ими. Затем эти вещества вымывают из колонки чистым растворителем. Выбор полимера для гель-фильтрации определяется размерами молекул и химическими свойствами разделяемых веществ, а также природой растворителя. [c.268]

Для фракционирования нуклеозидов можно использовать продажные гель-фильтрующие материалы Сефадекс G10 и G15 и Биогель Р2. Преимущества этих материалов в том, что элюируемые вещества не размываются по колонке, количественно снимаются с колонки и нет необходимости применять солевые градиенты. Также маловероятно, что в условиях гель-фильтрации будут протекать какие-либо химические процессы деградации лабильных нуклеозидов, т. е. что-либо похожее на процессы, обязательно происходящие при ионообменной и адсорбционной хроматографии. 127]. [c.74]

Описаи также метод, который в принципе представляет собой обратную модификацию методики, упомянутой выше [5]. Сначала готовят агаровую пластинку, в которой затем вырезают полоски геля и, удалив их, освободившееся место заполняют суспензией сефадекса. После этого проводят гель-фильтрацию в образованных таким образом слоях сефадекса. Дальнейшие этапы те же, что и при иммуноэлектрофорезе. [c.241]

Для Э. X. используют макропористые неорг. или полимерные сорбенты. Для Э. х. полярных полимеров неорг. сорбенты (силикагели и макропористые стекла) модифицируют кремнийорг. радикалами, а дги Э. х. гидрофильных полимеров -гидрофильными фуппами. Среди полимерных сорбентов наиб. распространены стирол-дивинилбензольные (для Э.х. высокополимеров и олигомеров). Для гель-фильтрации биополимеров, превде всего белков, используют гидрофильные полимерные сорбенты (сефадексы - декстраны с поперечными сшивками, а также полиакриламидные гели) или модифицированные полисахаридами макропористые силикагели. [c.411]

Принцип этого метода состоит в том, что анализируемые растворы медленно фильтруются через колонки, заполненные гелем. Поэтому метод называют также гель-фильтрацией. Частицы геля состоят из гибких линейных молекул высокомолекулярных вешеств (ВМВ), сшитых поперечными связями. Сетчатая структура геля способствует его набуханию в воде. Набухший гель имеет пористую структуру с различным содержанием пор разного диаметра. Распределение пор по размерам или по микрообъемам является основной характеристикой геля. Она зависит от природы ВМВ, температуры и природы растворителя. [c.361]

Предварительное фракционирование с помощью полиакриламидного геля дает такие же результаты, как и гель-фильтрация на сефадексе. В отличие от природного декстранового геля, каким является сефадекс, полиакриламидный гель представляет собой гель синтетического полимера, обладающий чрезвычайно малыми абсорбционными свойствами. Поэтому разделение на полиакриламидном геле можно провести практически без потерь фракционируемого материала. Молекулярный вес фракционируемых веществ также очень существен для разделения на полиакриламидном геле. Чем ниже молекулярный вес компонентов разделяемой смеси, тем меньше индекс биогеля, который целесообразно использовать для фракционирования. [c.228]

Как и для двух предыдущих видов хроматографии, здесь можно отметить, что для пористых сорбентов имеет место некий вклад гель-фильтрации, которым также можно пренебречь ввиду того, что за счет ионного взаимодействия [c.250]

Л. 6 выделяют из микросом путем центрифугирования клеточного гомогената при ускорении 105 000 g с послед, осаждением белков сульфатом аммония. Индивидуальные белки получают фракционированием с помощью хроматографии (в т. ч на гелях агарозы, содержащих ковалентно иммобилизованные фосфолипиды, и гель-фильтрацией на сефадексе), а также изоэлектрич. фокусированием в градиенте pH. Активность Л. б. определяют по перераспределению метки (изотопной, спиновой или флуоресцентной см. Липидные зонды) между донорными мембранами, содержащими меченые липиды, и немечеными акцепторными мембранами. [c.598]

Наиболее распространенным методом экстракции липидов является метод Фолча. Экстракцию проводят смесью хлороформ—метанол (2 1) из расчета 20 частей экстрагирующей смеси на одну часть ткани. Метод позволяет выделить 90—95% всех клеточных липидов. Смеси растворителей, содержащие спирт, экстрагируют также нелипидные вещества (сахара, аминокислоты, соли и т. д.) Для удаления нели-пидных примесей экстракт липидов промывают водон или слабыми солевыми растворами. Однако это приводит к частичной потере кислых липидов. Очистку экстракта можно провести также гель-фильтрацией на сефадексе. [c.68]

Е сли число компонентов, присутствующих в пробе, превышает пиковую емкость, то неизбежно перекрывание пиков, и в одном пике будут элюироваться два или большее число компонентов. Таблица 5.1-4 показывает типичные значения пиковой емкости для газовой хроматографии (ГХ), жидкостной хроматографии (ЖХ) и гель-фильтрации (см. также рис. 5.1-7). [c.244]

Некоторые компоненты удалось получить в чистом виде и подробно проанализировать. Методами ионообменной хроматографии и гель-фильтрации был изолирован [80] альбумин с молекулярной массой 16 000 Да, который не имеет свободной SH-группы. Изолирован и другой альбумин [62] с молекулярной массой от 26 000 до 31 ООО Да, также не имеющий свободной SH-группы. Анализ аминокислот показывает, что соотношение (ионные-(-полярные) неполярные = 0,71, тогда как этот альбумин превосходно растворяется в воде. Отсюда автор [62] делает вывод, что структура этих белков стабилизируется гидрофобным ядром, а боковые полярные и ионные цепи преимущественно вынесены в наружную часть молекулы, т. е. в водную среду. [c.181]

Большинство авторов определило молекулярные массы а-глиадинов (табл. 6Б.4) в пределах от 27 000 до 38 000 Да [72, 73]. Этот диапазон может отражать определенную изменчивость молекулярной массы поскольку при использовании этого же метода в отношении нескольких а-глиадинов установлены [116, 114] разные молекулярные массы для каждого из них. Завышенные величины молекулярных масс для аг и аг-глиадинов, полученные гель-фильтрацией [147], объясняются тем, что исследования проводились в 0,1 М уксусной кислоте без предварительного восстановления дисульфидных связей и в отсутствие денатурирующего агента (мочевины или гуанидинхлорида), а также тем, что в этих условиях а-глиадины находятся не в форме статистического клубка. Ввиду этого результаты оказываются искаженными за счет конформации, которую принимают в этой среде а-глиадины и стандарты белков. Все а-глиадины образованы одной полипептидной цепью. [c.188]

После 1940 г. произошел качественный скачок в разработке новых методов разделения, пригодных для разделения даже микроколичеств близких по строению веществ. Стало возможным, например, выделение минорных компонентов из экстрактов природного происхождения с помощью различных видов хроматографии, в частности, ионообменной хроматографии и гель-фильтрации. Со все возрастающей интенсивностью увеличивается число известных структур природных соединений, что обусловлено развитием спектроскопических методов исследования (УФ- и ИК-спектроскопии, спектроскопии ЯМР и масс-спектрометрии), а также рентгеноструктурного анализа. [c.342]

ГО исследования, а также хромотография и гель-фильтрация позволили в то же время обнаружить ряд новых белков сыворотки. Это в свою очередь не только способствовало выяснению деталей некоторых физиологических и патофизиологических процессов, но в значительной степени стимулировало изучение основных иммунологических явлений, расшифровку структуры белков и т. д. Разумеется, приводимые нами материалы о белках сыворотки нельзя считать исчерпывающими. Мы стремились познакомить читателя лишь с теми возможностями, которые открывает каждый из описанных методов, и надеемся, что настоящее руководство окажется полезным при выборе наиболее подходящего метода, а также при интерпретации полученных результатов для исследователей, работающих как с сывороточными, так и с другими белками. [c.8]

При групповом разделении смеси высокомолекулярные соединения не фракционируются. Гель-фильтрация в данном случае, подобно диализу, используется для отделения белков от низкомолекулярных примесей и может заменить его. Обессоливание белков можно проводить на сефадексах G-25 и G-50, а также на биогелях Р6 и РЮ. Для обессоливания пептидов следует применять сефадексы G-10 и G-15 или биогели Р2 и Р4. [c.221]

В соответствии с определением, данным в статье (11, а], ири гель-фильтрации используют водные растворы и гидрофильные гели, а ири гель-ироникающей хроматографии — органические растворителп и гидрофобные гели. Фильтрование через гель применяется ири биохимических исследованиях и ири изучении природных соединений, гель-прони-кающая хроматография—для исследования синтетических высокомолекулярных соединений. Указанные методы включают также хроматографирование, или фильтрование , на молекулярных ситах [12]. Гель обычно характеризуют размерами молекул (точнее, интервалом молекулярных весов молекул), которые оп достаточно эффективно разделяет. [c.399]

Между тем все выделенные фракции невосстановленных белков имеют сложный состав. Фракционирование единиц глютенинов после восстановления дисульфидных связей алкилирования позволяет отделить более простые фракции. Для этого в основном применяют методы электрофореза ДДС-Na-nAAF, электрофокусирование, ДДС-Na-nAAr совместно с электрофокусировкой [20, 92, 108], но с определенным успехом использовали также гель-фильтрацию и ионообменную хроматографию. [c.200]

Хюбнер и др. [98] разделяли глютенины после восстановления и алкилирования (Я -глютенины) гель-фильтрацией на сефадексе G 200 (0,03М уксусная кислота, 4М мочевина) на три фракции (А, В, С) равной величины, из которых первая (А) обнаружена в агрегированной форме. Две неагрегированные фракции (В, С) были повторно фракционированы ионообменной хроматографией на сульфоэтилцеллюлозе. В таких условиях фракция В разделяется на 7 фракций, из которых некоторые, хотя состоят из нескольких субъединиц с разными молекулярными массами, при электрофорезе в кислом pH ведут себя как гомогенные. Аналогичные результаты получены [89] при фракционировании на сефадексе G 100. Данно и др. [58] добивались аналогичного разделения путем. избирательного осаждения субъединиц этанолом. Для фракционирования субъединиц глютенинов используются также гель-фильтрация и ионообменная хроматография после избирательного растворения в уксусной кислоте [127]. [c.200]

В связи с изучением механизма биосинтеза пуромицина было исследовано ферментативное метилирование 0-деметилпуро-мицина [86]. Это соединение было синтезировано и очищено на колонке с силикагелем. Полученный из предшественника пуро-мицин выделяли ТСХ на целлюлозе и идентифицировали ТСХ и электрофорезом на бумаге. Для очистки пуромицина использовали также гель-фильтрацию на биогеле Р-2 в 0,01 М растворе карбоната аммония, содержащем 0,05% додецилсульфата натрия [87]. [c.226]

Это совершенно своеобразный вид хроматографии, основанный на использовании различия в размерах молекул. Его называют также гель-фильтрацией или ситовой хроматографией. Неподвижной фазой в гель-хроматографии является растворитель, находящийся в порах геля, а подвижной — сам растворитель, т. е. и подвижную и неподвижную фазы составляет одно и то же вещество или одна и та же смесь вещества. Гель готовят на основе, например, декстрана, полиакриламида или других природных и синтетических соединений. [c.350]

Кстати, отсюда следует, что хуже всех разделяются самые крупные молекулы, которые едва входят внутрь гранул (K v = 0,1 -i- 0,2). Выгоднее, таким образом, выбрать норпстость матрицы (но графикам селективности) так, чтобы разделение наиболее важных компонентов смеси происходило при значениях Kav в диапазоне 0,6—0,8. Конечно, в этом случае интересующие экспериментатора компоненты смеси будут двигаться вдоль колонки медленнее что будет способствовать расширению их пиков за счет продольной диффузии, но в отличпе от других хроматографических методов такое замедление скажется не очень сильно, ибо полный объем элюции, как уже отмечалось, невелик. Неоднородность размеров гранул также особо неблагоприятно сказывается в методе гель-фильтрации, поскольку явления диффузии здесь играют главную роль. [c.113]

Матрицы для гель-фильтрации с аналогичными свойствами выпускает также венгерская фирма Reanai под названием Молселект (Г-10 - Г-200). [c.116]

Сефакрилы. Структура, а также химические и адсорбционные свойства материала этих матриц (декстран, сшитый метиленбисакри-ламидом) были описаны выше. Главным его достоинством — по сравнению с сефадексом — является жесткость, благодаря чему гель-фильтрацию на сефакрплах, в том числе на крупнопористых, можно вести при относительно больших скоростях элюции. [c.117]

Частичный гидролиз полисахаридов позволяет выделить фрагменты с промежуточной молекулярной массой и разделить их с помощью таких хроматографических методов, как гель-фильтрация, ионообменная или распределительная хроматография. Строение этих более простых олигосахаридов установить легче, чем строение исходного полисахарида. Если все гликозидные связи в полисахариде гидролизуются с одной и той же скоростью (как, например, в линейных гомополисахаридах), то, например, в случае-амилозы продукт частичного гидролиза будет состоять из глюко.чы и ряда олигосахаридов — мальтозы, мальтотриозы и мальтотетра-озы. В гетерополисахаридах присутствуют гликозидные связи разных типов, и скорости гидролиза их различны. Фуранозиды обычно гидролизуются быстрее пиранозидов в 10—1000 раз, что приводит например, к удалению остатков арабинофуранозы, связанных с остатками ксилопиранозы в арабиноксиланах. Условия гидролиза влияют также на специфичность расщепления полисахарида. (1- 6)-Связи более устойчивы к действию минеральных кислот чем (1- 4)-связи, однако если гидролиз проводился в уксусном ангидриде, содержащем около 5 % серной кислоты, менее устойчивы (1-)-б)-связи. Параллельное использование этих двух методов гидролиза, приводящих к образованию фрагментов разного состава, позволит лучше воспроизвести строение полисахарида. Концентрация углеводов в реакционной смеси должна быть ниже [c.219]

Накоплен большой оиыт псиользования гель-фильтрации для очистки рибосом, полисом и ферментов, участвующих в биосинтезе белка и образующих комплексы с нуклеиновыми кислотами, нуклеотидами, а также аминокислотами. Например, при исследовании аминоацилирования тРНК для отделения аминоацил-тРНК-син-тетаз и их комплексов с АТФ и аминокислотами от свободных ами- [c.141]

Пример 3. Очистка ДНК-полимеразы а из зародыша цыпленка [Yamagu hi et al., 1982]. Аффинной хроматографии здесь также предшествовали четыре стадии ионообменной хроматографии и гель-фильтрация. Сорбция фермента на голубой агарозе в этом [c.421]

Наиболее эффективным и широко применяемым методом фракционирования сложных смесей липидов является хроматография. Главную роль при аналитическом фракционировании играет адсорбционная хроматография в тонком слое сорбента. Этот метод также применяется в препаративных целях, когда разделению подвергается небольшое количество липидов (50—300 мг). Если масса липидов превышает 300 мг, используют колоночную хроматографию, хотя по разделяющей способности и времени разделения этот метод часто уступает тонкослойной и газовой хроматографии. Однократного хроматографирования обычно бывает недостаточно для выделения индивидуальных веществ, в связи с этим полученные фракции подвергают препаративной тонкослойной хроматографии или колоночной хроматографии другого типа. При колоночрюй хроматографии липидов используют не только принцип адсорбции, но и принцип распределения между двумя несмеши-вающимися жидкостями, гель-фильтрации, ионного обмена. [c.69]

Для исследования спектра И. используют ионообменную хроматографию, гель-фильтрацию, электрофорез и изоэлектрофокусирование, а также иммунохим. методы с использованием антител. Наиб, широко используется диск-электрофорез в полиакриламидном геле. Однако применение только этого метода для поиска И. недостаточно, т. к. он не позволяет выявить генетически разл. формы ферментов, не различающиеся по заряду. В связи с этим для более полной характеристики спектра И. необходимо применять иммунохим. аиализ и сравнивать спектры И. мутантов. При выявлении И. необходимо избегать условий выделения, при к-рых возможно возникновение артефактных форм. Так, для предотвращения частичного протеолиза в процессе выделения и хранения работу часто проводят в присут. ингибиторов протеаз. При разделении мембранных ферментов необходимо максимально снижать концентрацию детергента, что позволяет избежать появления новых форм в результате образования мицелл с разным содержанием искомого мембранного фермента. Процедура выделения И. должна быть максимально сокращена по времени. [c.202]

Малые моноламеллярные Л. получают из многослойных при обработке их ультразвуком, при впрыскивании спиртового р-ра липидов в волную среду, продавливанием под большим давлением воднолипидных дисперсий через небольшое о1верс1ие, а также удалением детергента, солюбилизирующего липид, диализом или гель-фильтрацией. Такие Л. содержат 0,2-1,5 л воды на 1 моль липида. Малые [c.604]

Вместо последовательного экстрагирования можно полностью перевести в растворимую форму весь набор белков клейковины до разделения их на отдельные группы. Так, Орт и Бу-шук [142] солюбилизировали 98 % белков клейковины в смеси УМЦ — 0,1М уксусной кислоты, ЗМ мочевины, 0,01М цетилтри-метиламмоний бромида. Затем этот раствор титровали этанолом до конечной концентрации 70 % и подводили pH до 6,4, что позволяло отделить глиадины, которые оставались растворимыми, от глютенинов, нерастворимых в этой среде. Их можно также разделять методом гель-фильтрации [78]. Предложен метод [175] получения из муки очищенных глютенинов последовательными осаждениями сульфатом аммония. [c.179]

Возможно идентифицировать и смеси коротких пептидов, получаемых после обработки белков ферментами, частичного разделения с помощью гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Сопоставление масс-спектров, полученных при различных температурах источника, а также использование полного метилирования и дейтерометилирования, обычно позволяют правильно идентифицировать пики исходных пептидов. [c.278]

В тех случаях, когда это возможно, первая стадия включает солюбилизацию в водном илн апротонном растворителе, например в этиленгликоле или диметилсульфоксиде эту операцию необходимо проводить с осторожностью, чтобы быть уверенным, что в условиях данного метода и при применении выбранного растворителя макромолекулы не модифицируются и не разрушаются. Лоэтому на данной стадии нельзя применять кислоты, основания или ферменты. Низкомолекулярные примеси легко удаляются диализом (разделение по размеру молекул), ионообменной хроматографией (разделение по заряду молекул) или гель-фильтрацией (разделение по размеру молекул) (см. разд. 26.3.2.6). Последние два метода широко применяются также для отделения макромолекулярных примесей. Макромолекулы выделяют из раствора [c.216]

Серия Ш LH-20 и LH-60 получают из G-25 и G-50 путем гидроксипропилирования. Характер разделения может определяться не только гель-фильтрацией, но также адсорбционной и распределительной хроматографией. Устойчивость такая же, как и у серии G. Могут быть использованы в органических или водно-органических растворах. Степень набухания и, следовательно, эффективный интервал фракционирования зависят от используемого растворителя и конформации фракционируемых веществ. [c.439]

Тонкослойный вариант гель-фильтрации был предложен Детер-маном [6], а также Иоханссоном и Римо [11 ] и оказался весьма полезным для микроанализа и быстрого сравнительного анализа нескольких образцов исследуемого материала. Эндрюс [1 ], а позднее Моррис [12] применили тонкослойную гель-фильтрацию для определения молекулярного веса белков на основе установленной ими линейной зависимости между логарифмом молекулярного веса данного белка и расстоянием, пройденным им в слое данного носителя за определенный помежуток времени. В соответствии с этим можно ориентировочно определять молекулярные веса неизвестных белков, если одновременно проводить гель-фильтрацию стандартных белков известного молекулярного веса. Когда исследователь располагает достаточно чувствительными методами обнаружения белка в слое носителя, для определения молекулярного веса достаточно всего лишь нескольких микрограмм исследуемого материала. При определении молекулярного веса белков гель-фильтрацией в тонком слое следует иметь в виду, что подвижность данного белка при хроматографии в гель зависит не только от молекулярного веса, но и от формы его молекул. Поэтому определение молекулярного веса с помощью гель-хроматографии правомерно лишь в том случае, когда форма молекул исследуемого белка незначительно отличается от < рмы молекул стандартных белков, используемых для калибровки. [c.238]

Наиболее подходящая толщина слоя носителя — 0,5 мм. Для нанесения носителя на пластинки могут быть использованы описанные выше приборы, позволяющие получать слой разной толщины. Если суспензию носителя раскатывать стеклянной палочкой, на обоих концах которой наклеено несколько витков изоляционной ленты, также образуется достаточно ровный слой. Свежеприготовленные пластинки в течение 20—25 мин подсушивают на воздухе. Их можно довольно долго хранить во влажной камере, если исключена возможность бактериального роста. При нисходящей тонкослойной гель-фильтрации пластинку располагают в камере под углом 10—15° Как правило, гель-фильтрацию проводят в водных растворах, поэтому хроматографическая камера может быть изготовлена из пластмассы. Она состоит из кюветы для буферного раствора, рамки, поддерживающей пластинку под соответствующим углом, и крышки. Подача буферного раствора на пластинку осуществляется с помощью фитиля из фильтровальной бумаги. В качестве маркеров удобно использовать окрашенные высокомолекулярные вещества (например, меченные флуоресцеином ферритин или 7-глобулин), которые не задерживаются частицами геля. Гель-фильтрацию проводят до тех пор, пока маркер не пройдет по крайней мере 10 см от линии старта. После этого пластинку извлекают из рамки и покрывают слой носителя листом фильтровальной бумаги (например, Шляйхер-Шуль 2043 или ватман 3 ММ), вырезанным по размеру пластинки. Некоторые исследователи рекомендуют применять в этом случае лист сухой фильтровальной бумаги. В нашей лаборатории используется смоченная и тщательно отжатая фильтровальная бумага, так как с ее помощью легче прикрыть слой носителя без образования под бумагой пузырьков воздуха. После этого бумагу снимают (иногда вместе с частичками геля), высушивают при температуре около 120°С и окрашивают красителями, выявляющими белок, или реактивом Паули. Наряду с другими красителями можно воспользоваться, например, амидовым черным ЮВ, кислым фуксином и т. п. Во время отмывания несвязавшегося красителя частички геля отделяются от бумаги, и после высушивания она может быть использована для документации. [c.239]

В последние годы все большее распространение получает хроматографическое разделение веществ по их молекулярному весу, причем первое место среди таких вариантов хроматографии принадлежит гель-фильтрации на сефадексах . Сефадекс представляет собой полусинтетический -сорбент полисахаридной природы, гранулы которого обладают порами определенного размера, так что диффузия внутрь этих гранул возможна только для молекул, величина которых не превышает величину пор. Поэтому сефадекс работает как своего рода молекулярное сито , задерживающее проникающие внутрь гранул низкомолекулярные вещества и не задерживающее полимеры. Гель-фильтрация незаменима для быстрого отделения полимера от низкомолекулярных примесей (неорганических солей, мономеров и т. д.). Ее применяют и для разделения полимеров, причем одновременно можно приблизительно оценить их молек лярный вес, так как существует набор сефадексов, различающихся величиной пор. Есть все основания полагать, что в химии полисахаридов этот перспективный метод будет находить все большее применение. Особенно интересным является использование сефадексов для разделения высоко- и низкомолекулярных осколков, образующихся при расщеплении биополимеров различными реагентами , и для выделения полисахаридов из различных природных источников Хроматография на модифицированных сефадексах, обладаюш.их ионообменными свойствами, например на диэтиламиноэтилсефадексе, также может служить эффективным приемом фракционирования полисахаридов . [c.487]

Для разрушения пептидной части гликопротеинов широко применяется протеолиз, особенно часто под действием проназы (обычно из 81гер1от св5 г15тч), которая является набором мощных протеиназ, способных разрушать пептидные цепи, устойчивые к другим протеолитиче-ским ферментам. Часто употребляются также трипсин, химотрипсин, па-паин. Гидролизат, полученный после обработки протеиназами, подвергают фракционированию с применением диализа, гель-фильтрации и хроматографии (см., например, ), выделяя один или несколько низкомолекулярных гликопептидов, структуру которых устанавливают обычными методами и иногда подтверждают встречным синтезом. Впервые гидролиз гликопротеина трипсином был применен Нейбергером для выделения фрагмента овальбумина, содержащего узел связи олигосахаридной и пептидной части молекулы в дальнейшем для этой же цели использовали также химотрипсин, пепсин и другие фepмeнты " . . Протеолиз проназой очень широко применялся при выделении узловых фрагментов из 7-глобулина , тиреоглобулина фибриногена и особенно му- [c.571]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология