Белки, анализ сывороточные

НЫМИ катионогенными и анионогенными группами. В отличие от этого кислотный гидролиз сывороточного альбумина приводит к образованию фрагментов, проявляющих иные сорбционные свойства по сравнению со свойствами исходного белка. Анализ взаимодействия белков с ионообменными смолами весьма существен для развития представления о механизме межмолекулярных взаимодействий белков с другими электролитами и полиэлектролитами. Так, например, взаимодействие фермент—субстрат в том случае, когда субстрат является электролитом, также должно определяться и расположением ионогенных заряженных групп в обеих молекулах. [c.196]

Хорошим примером изучения нативных белков является исследование белков сыворотки крови, включающее их выделение, очистку, количественный и качественный анализ. Широкое применение методов анализа белков будет показано нами именно на примере изучения сывороточных белков. [c.7]

Анализ аависимости z от т)/Г для радикалов 8 и 7 показал ее прямолинейность (рис. 4), что доказывает выполнение зависимости Стокса—Эйнштейна в рамках проведенного зксперимента. Следовательно, дополнительное вращение радикала относительно молекулы белка отсутствует, т. е. стероиды жестко связаны в комплексе с сывороточным альбумином. [c.117]

Реологические характеристики слоев глобулярных белков сывороточного альбумина и лизоцима, вычисленные по измерениям деформаций во времени, приведены в табл. 20 и на рис. 54. При повышении температуры от 20 до 60 С происходит нарастание всех характеристик структуры слоя. С помощью седимента-ционного анализа и электрофореза в растворах ЧСА, подвергнутых нагреванию, обнаружено было три компонента — нативные молекулы, денатурированные молекулы и агрегаты последних. При нагревании в течение некоторого времени устанавливается равновесие между этими компонентами, зависящее от температуры [165]. Образование межфазного слоя ЧСА на границе раздела жидких фаз при повышенных температурах (30—40° С) приводило к усилению твердообразных свойств слоя, о чем свидетельствуют значения модулей эластических деформаций, вязкость эластичности и периоды упругого последействия. [c.232]

Как мы уже видели, облучение белков вызывает изменения их молекулярного веса. Фибриноген [58,70] при облучении образует небольшие фрагменты и большие агрегаты. Растворы сывороточного альбумина быка [61—63] образуют большие агрегаты без образования мелких фрагментов, что установлено седиментационным анализом в ультрацентрифуге. Облучение 0,07%-ного водного раствора рентгеновскими лучами дозой 75 000 р при 25° вызывает преципитацию белка. Однако при 0 преципитации не происходит [62]. Выпадение белка можно замедлить или устранить повышением концентрации белка или добавлением солей. Это явление сходно с тепловой денатурацией. [c.227]

В отличие от карбоксипептидазы большая часть природных белков не содержит ионов металла в активном центре. Ионы металлов часто образуют с белками обратимые комплексы. Бычий сывороточный альбумин (БСА) связывает до 20 ионов переходных металлов на молекулу. В соответствии с данными фиг. 78 можно ожидать, что при физиологических pH происходит связывание с имидазолом или карбоксильными группами, расположенными благоприятно для образования комплексов, что, по-видимому, и имеет место в данном случае. Однако из фиг. 78 следует также, что единственная сульфгидрильная группа в БСА должна быть местом преимущественного связывания металла. Так, каждый третий ион меди, приходящийся на молекулу БСА, по-видимому, связывается с сульфгидрильной группой. На высокую специфичность связывания с ионами металлов указывает также возможность получения для целей рентгеноструктурного-анализа производных гемоглобина и миоглобина, содержащих тяжелые атомы. [c.414]

Удивительно, однако, что соответствие получено и при определении молекулярных весов сывороточного альбумина, лактоглобулина и некоторых других белков, которые при электрофоретическом анализе оказались смесями из нескольких компонентов. В то время как молекулярные веса, определенные при помощи рентгеноструктурного анализа (табл. 5), прекрасно согласуются с молекулярными весами, полученными другими [c.65]

Результаты электрометрического титрования для многих белков достаточно хорошо совпадают с результатами химического определения аминокислотного состава. Так, общее число анионных и катионных групп, определенное электрометрически в яичном альбумине, лактальбумине [19] и сывороточном альбумине [22], почти совпало с числом кислых и основных аминокислот, найденных при соответствующем химическом анализе. В других белках, однако, например в инсулине, был обнаружен значительный избыток групп, титруемых в щелочной области pH [22], что объясняется наличием в инсулине большого числа конечных сс-аминогрупп. [c.82]

Систематические элементарные анализы белковых веществ, знаменовавшие переход белковой химии в следующий период ее истории, начали проводить с 1820 г., когда В. Праут (1785— 1850 гг.) опубликовал данные своих анализов белка [361]. Использованный им белок был выделен из крови особы, страдавшей легким воспалением, но в прочем здоровой и представлял собой (насколько можно судить по описанию метода выделения) неочищенный сывороточный альбумин. Процентное содержание в [c.27]

Эти исследователи определили содержание тирозина и триптофана в сывороточном альбумине человека и лошади. Сравнение полученных результатов с данными, полученными другими методами, в этом случае провести трудно, так как применявшиеся белки получались такими способами, которые радикально отличаются от применяемых в настоящее время. Годвин и Мортон [54] воспользовались этим методом для анализа различных белков сравнительные данные приведены в табл. 3. [c.222]

Следует привести еще несколько примеров успешного применения гель-фильтрации в тонком слое. Линк [36] показал, что фракционирование в тонком слое можно проводить в присутствии 8М мочевины или 6,5 М хлоргидрата гуанидина. В этих условиях он сопоставил скорости миграции нативного и модифицированного (восстановленного и алкилированного) р-белка из спинномозговой жидкости. Совпадение скорост-ей миграции обоих образцов указывало на отсутствие в белке субъединиц с различным молекулярным весом. В сочетании с электрофорезом тонкослойную гель-фильтрацию применяли как удоб1у>1й метод контроля при выделении аминоацил-т-РНК-синтетаз [37]. При сопоставлении результатов анализа путем тонкослойной гель-фильтрации на G-200 двух фракций с валил-т-РНК-синтетазной активностью, но несколько различавшихся в функциональном отношении, оказалось, что обе фракции довольно близки по размерам молекул [38]. Радола [67] использовал тонкослойную гель-фильтрацию для решения ряда задач к ним относится анализ сывороточных белков животных и человека, растворимых белков культуры клеток млекопитающих in vitro, растворимых белков из листьев шпината. [c.266]

Фиг. 25. Фото1 рафия, иллюстрирующая возможность количественного анализа сывороточных белков с помощью электрофореза в крахмальном геле.

В 1828 г. (по данным И. Гмелина — в 1827 г. [233]) вышла из печати диссертация Ф. Михаэлиса [322], посвященная исследованиям составных частей артериальной и венозной крови. Специальный раздел диссертации был отведен анализам сывороточных белков и сравнительным определениям содержания в них углерода, водорода, азота и кислорода. Свои анализы Михаэ-лис проводил по методу Ж. Гей-Люссака и И. Доберейнера, прокаливая исследуемые вещества с окисью меди. Для того чтобы можно было составить представление о первых методах элементарного анализа белковых веществ, вкратце опишем способ анализа, использованный Михаэлисом. Этот способ состоял в следующем 1 г размельченного вещества высушивали над серной [c.28]

I. Электродный буфер и буферы для гел1Я. При pH 8,6 большинство белков мигрируют к аноду, поэтому для анализа сывороточных и других белков обычно используют барбита-ловый буфер, pH 8,6, а лунки вырезают иа катодной стороне пластины. Однако для лучшего разделения белков с другим и [c.219]

Основные вопросы, связанные с иммобилизацией белков. При рассмотрении вопросов, связанных с иммобилизацией белков, в первую очередь необходимо отметить, что при иммобилизации белок частично денатурируется, то есть, по наиболее общему определению, изменяет в какой-то степени свои первоначальные (нативные) характеристики. Эти изменения происходят как под воздействием физико-химических условий синтеза (температура, состав и концентрация модифицирующего раствора), так и в результате ковалентной межмолекулярной сшивки. Поэтому условия синтеза гетероповерхностного сорбента, предназначенного для анализа биологических проб с прямым вводом, следует подбирать таким образом, чтобы, с одной стороны, не происходило значительных изменений нативной глобулярной структуры белка для создания максимально однородного внешнего покрытия частиц, а с другой — чтобы уже иммобилизованный белок был лишен детерминантных групп (активных центров) для устранения возможных биоспеци-фических взаимодействий с содержащимися в пробе белками. Хотя для иммобилизации используются преимущественно инертные белки (например, сывороточный альбумин), их инертность весьма относительна. Но, по крайней мере, такое допущение принимается по сравнению со специализированными белками. Примерно в половине работ, посвященных созданию селективных электродов и сорбентов при иммобилизации ферментов, последние иммобилизуются совместно с альбуминами или коллагеном, либо на их матрицы. [c.544]

Вследствие доступности и важности белков сыворотки крови, особенно сывороточного альбумина, их чаше всего выбирают в качестве модели при изучении процессов связывания. Из анализа Скэтчарда известно, что связывание с белками является многоступенчатым равновесием, т. е. включает ряд центров связывания, у которых сродство к лиганду может быть различным. Вполне возможно, что суммарный результат и общая константа связывания могут оказаться различными для двух энантиомеров. Более того, исходя из часто демонстрируемой ферментами субстратной энантиоселективности можно предположить, что у других белков также возможно наличие центров сорбции, обладающих высоким сродством и энантиомерно-дифференцирующей способностью. [c.132]

Суть бесколоночного метода заключается в следующем. Фракционируемую сыворотку смешивают с уравновешенным соответствующим буферным раствором ДЭАЭ-сефадексом, который связывает почти все сывороточные белки, оставляя в растворе IgG, легко отделяемый при отмывании. Смешивание с ДЭАЭ-сефадексом повторяют дважды (каждый раз со свежей порцией ионообменника) и в результате получают препарат IgG, свободный от примеси других белков сыворотки, о чем судят по иммуноэлектрофоретическому анализу. Благодаря тому что фракция IgG совсем не связывается с ионообменником, белки этого класса удается выделить почти количественно в нативном состоянии, не опасаясь денатурации, что является большим преимуществом данного метода по сравнению с другими методами выделения IgG. [c.219]

Изложенный выше подход к анализу упаковки макромолекул может быть применен и к белковым молекулам. В табл. 4.4 показан аминокислотный состав пяти белков, для которых проведены соответствующие расчеты, — лизоцима, яичного альбумина, термолизина, рибонуклеазы и сывороточного альбумина. В таблице приведены ван-дер-ваальсовы объемы аминокислотных остатков (а не самих аминокислот), входящих в первичную структуру белка. Результаты расчета приводят к следующим значениям ван-дер-ваальсовых объемов белковых молекул ли-зоцим— 12 526,9 А , яичный альбумин — 38 632,72 А , термолизин — 36 688,7 А , рибонуклеаза — 12 071,0 А , сывороточный альбумин— 58 105,65 А . Молекулярная масса лизоцима, яичного альбумина и сывороточного альбумина человека составляет 14 277, 42 791 и 64 427, а плотность в стеклообразном состоянии— 1,31 1,27 и.1,27 г/см . Отсюда коэффициенты молекулярной упаковки к равны для лизоцима — 0,691, для яичного альбумина и сывороточного альбумина — 0,690. Эти величины соответствуют среднему значению коэффициента молекулярной упаковки в блочных стеклообразных полимерах. [c.141]

Солюбилизация углеводородов изучалась в водных растворах глобулярных белков яичного альбумина, сывороточного альбумина, 7-глобулина, лизоцима, а-кааеина, пепсина, а-химотрнпси-на, трипсина. Анализ аминокислотного состава белков позволил сделать заключение об определяющей роли гидрофобных взаимодействий в стабилизации их глобулярной структуры. [c.22]

Внутримолекулярная водородная связь приводит к образованию другой стабильной конформации белка — правой ос-спирали Виток а-спирали содержит 3,6 аминокислотных остатка, каждая К-Н связь полипептидной цепи связана водородной связью с С=0 группой четвертой от нее аминокислоты (рис 25 2) а-Спираль встречается очень часто Например, а-кератин шерсти является а-спиралью на 100%, миоглобин и гемоглобин — на 75%, сывороточный альбумин — на 50% Природные белки обычно представляют собой комбинации а-спиральных, /3-складчатых и неспирали-зованных участков в различных соотношениях Теория вторичной структуры белков (Л Полинг, Р Кори, 1951, Нобелевская премия 1954 г) позволила методами рентгенострук-гурного и кристаллографического анализов определить [c.883]

Существует значительный разрыв между числом статей, описывающих газохроматографические методы, и числом работ, посвященных приложению этих методов. Качественные анализы или же анализы, ограничивающиеся измерением лишь нескольких аминокислот пептидных или белковых гидролизатов . были выполнены уже давно [25, 69, 88, 147]. Наиболее полными являются данные Герке проведенное им газохроматографическое определение аминокислот в гидролизатах бычьего сывороточного альбумина, каппа казеина, белка бобов [41] и рибонукле-азы [43] прекрасно согласуется с результатами, полученными на ионообменниках. В табл. 5, 6 и 7 приведены некоторые экспериментальные данные, полученные ГХ н-пропиловых эфиров ацетиламинокислот из нескольких пептидных гидролизатов. Для гидролизатов фибриноиептидов те же молярные соотношения (табл. 6) найдены на ионообменниках [62]. С помощью ГХ контролировался синтез брадикинина (табл. 7). [c.130]

Съемка газовая, оператор полевой партии 2777 Сыворотка крови определение белка 740и 7916, 7979 витамина Е 7357 воды 7204 пенициллина 7208 холестерина 8277 Сыворотки лошадиные, титрование потенциометрическое 8073 Сывороточно-вакцинное производство, определение pH 650 Сыпучие тела, отбор проб 2510 Сыр анализ 6466 определение азотистых соединений 8494 [c.391]

Так как нзоэлектрическая точка большинства белков лежит в кислой среде, то водные растворы их обычно заряжены отрицательно. В крови и органах животных среда немного щелочная. Это свойство белков используется при электрофоретическом анализе белкового состава биологических жидкостей. Например, в состав сыворотки крови входит альбумин и глобулин, которые отличаются своими изоэлектрическими точками (табл. 55). Поэтому при электрофоретическом анализе сыворотки крови, имеющей pH выше 7, эти белки, заряжаясь отрицательно, должны передвигаться к аноду с различной скоростью в силу различной величины своих зарядов. Наибольший заряд будет у альбумина сыворотки, так как он при этих условиях наиболее удален от своей изоэлектрической точки. Отсюда сывороточный альбумин наиболее подвижен. Происходит расслоение ранее однородной системы на фракции, движущиеся к аноду с различной скоростью. [c.359]

Для определения Ка и К в сыворотке проба сначала смешивается со стандартным раствором и затем диализуется для удаления белка. После дополнительного разбавления водного диализата небольшое количество этого раствора деаэрируется и непрерывно закачи-вается в пламя. Часть воздуха и большая часть жидкого потока сбрасываются с помощью вертикального тройника. Оставшийся поток закачивается через капиллярные трубки в основное пламя со скоростью 1 мл/мин. Содержание Ка и К в сыворотке должно составлять 100 -160 и 2-8 мэкв/л соответственно. Для К градуировочная кривая является линейной во всем диапазоне, В случае Ка эта кривая также линейна, однако при высоких концентрациях на ней наблюдается неболь шой изгиб. Определение обоих элементов, проверяемое путем введения стандартных добавок в сывороточные пробы, по существу является полным. Установлено, что воспроизводимость ана-таза составляет 0,75 мэкв/л для Ка и 0,15 мэкв/л для К. Скорость автоматического фотометрического анализа достигает 40 проб/ч, тогда как в ручных измерениях она составляет около 10 проб/ч. [c.180]

При пo юш,и метода Эдмана был изучен порядок чередования аминокислот в пептидах, однако до последнего времени использование этого метода для количественного анализа концевых аминокислот в белках с высоким молекулярным весом имело лишь частичный успех. В результате очень интересной модификации метода Эдмана, осуществленной Эриксоном и Шеквистом [52], оказалось возможным достигнуть количественного выхода при определении М-концевых аминокислот различных сывороточных белков. [c.169]

В качестве примера ниже приведена методика карбоксиметилирования сывороточного альбумина быка [81]. Раствор, содержа-ш,ий 500 мг кристаллического белка, 6 ммоль бромацетата и избыток окиси магния, осторожно встряхивают при 35°. За ходом реакции следят, отбирая пробы смеси для анализа различными метода-ьш. Полезными критериями для наблюдения за ходом реакции могут служить убыль аминного азота и отрицательный результат диазосочетания имидазольных и фенольных остатков. В случае бычьего сывороточного альбумина по мере протекания карбокснметилиро-вания дисульфидные связи становятся более доступными восстановлению это можно обнаружить, обрабатывая препарат сначала сульфитом, а затем раствором фосфомолибденовой кислоты по Фолину 82]. Спустя 27—72 час смесь центрифугируют и прозрачную надосадочную жидкость подкисляют до pH 2 соляной кислотой. Практически количественный выход карбоксиметилированного белка. [c.179]

Таким же путем, по содержанию некоторых аминокислот, были рассчитаны минимальные молекулярные веса р-лактогло-булина, сывороточного альбумина [1], эдестина [2] и других белков. Хотя подобный химический анализ не дает возможности определить истинные молекулярные веса, а лишь позволяет судить о минимальной их величине, он все же может оказаться очень полезным, в особенности если различные определения (по различным составным частям молекулы) дают одно и то же значение минимального веса. [c.48]

Изучены хироптические свойства, обусловленные активными дисульфидными хромофорами (разд. 2.21), а также КД некоторых специфичных белков, таких, как миоглобин, гемоглобин, инсулин, рибонуклеаза, сывороточный альбумин и лизоцим [433, 563, 587, 593, 594]. Кроме того, хироптические методы использованы для того, чтобы получить данные о структуре нуклеогисто-нов, о стабилизации рибонуклеиновых кислот природными или синтетическими полиоснованиями, а также о действии мочевины и додецилсульфата натрия на структуру яичного альбумина. Недавние исследования показывают, что в глобулярных белках эффекты Коттона часто имеют значительную величину и наблюдаются вблизи УФ-полос поглощения тирозина и триптофана. Исследование оптической активности триптофана, тирозина и производных фенилаланина, в частности, в связи с изучением рибонуклеазы показало наличие значительного эффекта Коттона, обусловленного полосой поглощения шести тирозиновых остатков. Сделана попытка систематического анализа этих эффектов [595]. Ряд простых производных, исследованных в растворителях, замерзающих при температуре жидкого азота, обнаруживают тонкую структуру как УФ-, так и КД-полос, что делает возможным анализ их колебательной структуры. Фенольный хромофор имеет два перехода в близкой ультрафиолетовой области. Исследованы соответствующие колебательные прогрессии, одна сильная и одна слабая. Их положение очень чувствительно к природе растворителя, и поэтому следовало ожидать, что в рибонуклеазе, которая имеет три защищенных и три незащищенных тп-розиновых звена, будут прогрессии, возникающие из обоих типов звеньев, если оба они обладают повышен- [c.94]

Выше было уже упомянуто об образовании слабо растворимых солей (например, хлоридов и сульфатов) белковых катионов з кислой по отношению к изоэлектрической точке области [195, 202] и об использовании этого явления, например, для выделёнйя кристаллического сульфата альбумина плазмы [106]. Было получено также несколько кристаллических солей лизоцима [204]. Белковые соли, содержащие тяжелые комплексные анионы, например воль-фрамат-, фосфовольфрамат-, трихлорацетат- или метафосфатионы, а также соли, содержащие катионы тяжелых металлов — цинка, меди или ртути, — известны уже давно и применялись для освобождения раствора от белков перед некоторыми анализами [10, 78]. Предполагалось, что эти реагенты при их применений действуют на белки сильно денатурирующим образом. Вслед з-а кристаллизацией цинковой соли инсулина [205, 206] и метафос-фата яичного альбумина [207] недавно последовало приготовление серии кристаллических производных инсулина [208] и сывороточных альбуминов человека [209, 210]. Последние были получены в присутствии ионов, концентрация которых была недостаточна для высаливания (если не добавлять в количестве 5—30% органического растворителя и во избежание денатурации не вести процесс при низких температурах). В этих условиях многие из указанных солей менее растворимы, чем свободный белок или соли с такими катионами, как натрий или калий, и, следовательно, могут найти применение при выделении белков [51] (4). Были получены также кристаллические додецилсульфатпроизводные Р-лактоглобулина [211]. [c.51]

В нейтральной или щелочной среде тирозиновые группы ряда белков реагируют с иодом легко и специфично, образуя 3,5-дииодтирозиновые группы. Тот факт, что замещение в этих случаях протекает селективно, был доказан тщательным анализом продуктов реакции сывороточного альбумина [93], зеина [94], пепсина [95], лактогенного гормона [96], инсулина [97] и шерсти [98]. Специфичности не наблюдалось в реакциях с гемоглобином [99] и рядом других белков [100], в которых происходило замещение или окисление имидазольных групп даже в нейтральной и кислой среде. [c.351]

Фенилизоцианат легко реагирует со многими белками при pH 8 и температуре 0°. Долгое время считали, что это вещество селективно взаимодействует с аминогруппами белков. Это мнение было основано главным образом на работах Вормелла с сотр. [176, 177], которые исследовали взаимодействие сывороточных глобулинов, казеина, желатины и инсулина с фенилизоцианатом и м-бромфенилизоцианатом. При определении в полученных производных количеств брома и остаточного аминного азота и сравнении этих результатов с известными данными по содержанию аминного азота в исходных белках оказалось, что число вошедших в состав продуктов реакции атомов брома соответствует уменьшению содержания аминного азота, хотя вызывает сомнения строгость проведения количественного анализа. Последующие опыты с уреазой [178], белком вируса табачной мозаики [179] и яичным альбумином [180] показали, однако, что сульфгидрильные группы и, возможно, гидроксильные группы тирозина также реагируют в аналогичных условиях с фенилизоцианатом. [c.368]

Швеция Тисемус А. Разработка методов электрофоретического и адсорбционно-хроматографического анализа и их применения для разделения сывороточных белков [c.540]

ТОК метода состоит в том, что иптепсивпость окрашивания различна для разных белков, причем эти различия могут достигать трехкратной величины. Для точных анализов необходимо поэтому строить калибровочный график по тому белку, который требуется определять, и нельзя пользоваться, как это часто делают, удобным, но произвольным стандартом типа сывороточного альбумина быка. Готтшалк [70] считает, что калибровка с помощью белкового компонента гликопротеинов неосуществима и это делает невозможным применение обсуждаемого метода для точных определений. Структурные особенности белка, определяющие интенсивность окраски, сложны и включают не только содержание тирозина и триптофана, но и последовательность некоторых аминокислот с функциональными группами в боковой цепи, особенно гистидина, аргинина и глутаминовой кислоты 1123]. Можно ожидать, что различие в содержании тирозина во фракциях гликопротеинов само по себе может давать ошибочные результаты [121]. [c.151]