Двухмерный электрофорез

При электрофорезе в кислой среде на крахмальном или полиакриламидном геле глиадины делятся по подвижности на а-, -, у- и СО-группы, каждая яз к-рых включает неск. белков. Гордеины делятся на С и В группы. Причем малоподвижные белки группы В-это S-бедные П. Глютенины при обычных условиях электрофореза остаются на старте. При двухмерном электрофорезе глиадинов выделено более 50 компонентов, причем разные сорта пшеницы существенно различаются по составу белков, относящихся к П. [c.100]

В крахмальном геле можно работать при pH от 2 до 11. Этим методом были изучены многие белковые смеси, прежде всего сыворотка крови и гемоглобины. Основные результаты этих работ можно найти в обзорах [43, 44]. Как уже говорилось, в сыворотке крови крахмальный гель позволяет обнаружить до 30 компонентов это количество столь велико, что до сих пор не установлено, какую сыворотку считать нормальной , так как у каждого животного и человека имеются индивидуальные, генетически детерминированные отличия. При сравнении с данными электрофореза на бумаге следует помнить, что порядок расположения компонентов в геле может быть совершенно иным. Кроме того, электрофореграмма в геле, вообще говоря, неаддитивна благодаря влиянию одних компонентов на подвижность других, так как присутствие белков в высокой концентрации в узких зонах приводит к локальным изменениям проводимости, pH и вязкости среды иногда наблюдается и прямое взаимодействие белков. Для сопоставления с результатами электрофореза сыворотки крови на бумаге применяют так называемый двухмерный электрофорез. В этом случае сыворотку сначала разделяют на бумаге. После этого зоны не фиксируют, а влажную бумагу прижимают к поверхности крахмального геля и проводят дополнительный электрофорез в геле в перпендикулярном направлении. Лишь после этого зоны проявляют. Этот метод позволяет еще более улучшить разделение. [c.97]

Поскольку все указанные методы можно сочетать друг с другом, число возможных вариантов двухмерного электрофореза огромно. На практике же число этих комбинаций несколько ограниченно, так как изоэлектрофокусирование применяют только в первом направлении (отчасти это обусловлено высокой стоимостью амфолитов-носителей), а ДСН-содержащие гели —только на второй стадии электрофореза из-за трудностей, связанных с удалением ДСН из комплексов с белками. В зависимости от изменений, вводимых при электрофорезе во втором направлении,, можно выделить следующие типы двухмерного электрофореза [c.229]

Как следует из предыдущего обсуждения, эффективность электрофоретического разделения зависит от многих факторов, в том числе от суммарного заряда молекул, ситового эффекта используемого для электрофореза носителя, присутствия денатурирующих агентов и т. п. Благодаря такой вариабельности электрофорез обладает исключительно высокой разрешающей способностью. Однако при исследовании сложной смеси, состоящей из многих белков (а такие исследования приходится проводить довольно часто) некоторые белковые зоны могут перекрываться. В подобных случаях электрофорез во втором направлении может привести к более полному разделению анализируемых веществ, и этот принцип лежит в основе методов двухмерного электрофореза. [c.227]

Более совершенная идентификация белков Р была проведена методом двухмерного электрофореза с изоэлектрическим фокусированием белков в одном направлении и SDS-электрофорезом в присутствии разрушающих агентов во втором направлении [101]. Обнаружено, что два полипептида Р являются относительно основными, а один из полипептидов Р — относительно кислый. Эти данные сделали номенклатуру белков Р более совершенной до момента выяснения всех их функций [101, 274, 295]. Более быстро мигрирующий основной белок Р, кодируемый 1-м сегментом РНК, назвали РВ2, медленно мигрирующий основной белок Р, кодируемый 2-м сегментом РНК, — РВ1, а кислый белок Р, кодируемый 3-м сегментом РНК, — РА (см. табл. 1 и 3). [c.42]

Электрофорез в первом направлении проводят обычным способом, а затем полученную электрофореграмму используют без фиксации и окрашивания в качестве стартовой зоны для электрофореза во втором направлении, перпендикулярном первому. Если оба этапа электрофореза осуществляют в идентичных условиях, то скорость миграции белков в обоих направлениях одинакова и зоны разделенных молекул располагаются по диагонали. Очевидно, что такие системы улучшают разделение лишь постольку, поскольку оно зависит от удлинения пути миграции разделяемых белков. Чтобы повысить разрешение в значительной степени, необходимо на втором этапе изменить по крайней мере один из электрофоретических параметров. В настоящей главе приводится краткое описание некоторых методов двухмерного электрофореза. Несколько дополнительных вариантов обсуждаются в главах, посвященных разделению определенных классов белков, в частности белков жидкостей тела, рибосомных и мембранных белков. [c.227]

К числу первых разновидностей двухмерного электрофореза относится сочетание электрофореза на бумаге с электрофорезом в крахмальном геле. По этому методу после электрофореза на бумаге полоску электрофореграммы помещают в щель, вырезанную в крахмальном геле, и проводят электрофорез во втором направлении обычным способом [1031, 1203]. Применение [c.227]

Был описан также метод двухмерного электрофореза, осуществляемого в обоих направлениях на одной пластине геля, Вейн [1391] проводил такой электрофорез в сигмоидном вогнутом градиенте концентрации полиакриламидного геля. Для его формирования использовали квадратную ячейку, в которую гелеобразующий раствор наливали с одного угла этой ячейки. В противоположный угол наносили образец и затем проводили электрофоретическое разделение в двух перпендикулярных направлениях. [c.230]

ДВУХМЕРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ С ИЗМЕНЕНИЕМ pH [c.230]

Ясно, что заранее трудно сказать, какая из разновидностей двухмерного электрофореза даст наилучшие результаты при разделении той или иной сложной смеси белков. Однако, зная основные принципы электрофоретических методов и некоторые характеристики белков разделяемой смеси, можно довольно хорошо подобрать систему, пригодную для разделения большинства компонентов. В дальнейшем же на основании результатов предварительных опытов электрофоретическая система может быть еще более усовершенствована. [c.234]

В последние годы широкое распространение для фракционирования белков получили различные сочетания изоэлектрофокусирования и диск-электрофореза в полиакриламидном геле —методы двухмерного электрофореза, которые позоляют параллельно анализировать сотни и даже тысячи белковых фракций. [c.32]

Рис. 96. л. Двухмерный электрофорез ядерных белков нормальной печени [943]. Электрофорез в первом направлении проводили в цилиндрических гелях, содержавших 10%-ный акриламид и 6 М мочевину, а во втором— на пластине геля, содержавшего 12%-ный акриламид и 0,1%-ный ДСН. Белки окрашивали кумасси ярким синим. Цифрами указаны зоны, отличающиеся по интенсивности окраски от тех же зон на электрофореграмме белков гепатомы Новикова. Б. Схематическое изображение электрофореграммы, представленной на рис. 96, А. Черные пятна обозначают наиболее интенсивно окрашенные зоны, заштрихованные —менее интенсивно окрашенные, светлые кружки —очень слабо окрашенные зоны, а пунктирные кружки — минорные компоненты. [c.308]

Наилучшее разделение рибосомных белков было достигнуто при использовании методов двухмерного электрофореза. В этих методах вначале проводят электрофорез в цилиндрическом геле, который затем помещают в аппарат, где формируют пластину второго геля. Белки, разделенные в первом направлении, подвергают электрофорезу в направлении, перпендикулярном оси цилиндрического геля. Для получения хороших результатов необходимо при разделении во втором направлении изменить либо заряд белков, либо ситовые свойства геля, либо оба этих параметра. [c.312]

Хата и Нагаи [524] предложили использовать для разделения компонентов смеси гликозаминогликанов двухмерный электрофорез на листах ацетата целлюлозы (рис. 127). [c.396]

Одномерный или двухмерный электрофорез в сочетании с хроматографией на бумаге является наиболее эф ктивным из известных методов изучения сложной смеси небольших количеств пептидов. Чтобы проиллюстрировать, насколько широк тот круг вопросов, изучение которых осуществляется сочетанием электрос реза и хроматографии, ниже кратко изложены некоторые методики, разработанные в ходе подобных исследований. [c.54]

Рис. 12.32. Двухмерный электрофорез олигонуклеотидов (по данным Браунли,

Когда еще не было приборов для двухмерного электрофореза (по Гроссу), удовлетворительные результаты получали сочетанием электрофореза с хроматографией. Диксон и др. [15] проводили электрофорез при pH 3,6 с последующим хроматографированием на бумаге в другом направлении с растворителем н-пропанол—пирофосфатный буфер. Лист бумаги ватман № 3 Т-образной формы с размерами, указанными на фиг. 23, свертывают до горизонтальной части т. Последнюю увлажняют с обоих концов буфером пиридин — уксусная кислота, pH 3,6, и проводят электрофорез при 1500 в в течение 20 мин. Диксон и др. применяли прибор Михля с жидким теплоносителем, но столь же успешно может быть использован прибор для электрофореза между горизонтальными пластинами. В последнем случае, прежде чем приступать к разделению, концы горизонтальной части Т, находившиеся в контакте с бумажными фитилями, следует отрезать. При pH 3,6 кислые аминокислоты (глутаминовая, аспарагиновая и цистеиновая) разделяются основные дают одно общее пятно, а нейтральные — другое. Если использовать для хроматографии систему П — Э — ФФ Хейнса и др. (см. [c.52]

Пептидную фракцию в количестве не более 0,1 мг наносят на бумагу в виде тонкой полосы длиной 2 см. Для двухмерного электрофореза Мильштейн и Сэнджер [20] применили удобную методику после разделения в первом направлении на бумажной полоске полоску пришивают на швейной машине к листу большего размера для второго разделения. Затем бумагу увлажняют буфером, используемым для разделения во втором направлении так, чтобы раствор, пропитывая бумагу с двух сторон, сконцентрировал зоны. [c.56]

Третий сегмент РНК кодирует кислый полипептид РА, имеющий у вируса PR8 м.м. 82 400 [61]. На основании данных секвенирования [25 J. Robertson, I. Roditi, в печати] и двухмерного электрофореза в ПААГ с неуравновешенным pH и градиентом SDS [98, 100] -считают, что продукт сегмента 3 является кислым белком у всех изученных штаммов вируса гриппа А и В. [c.219]

Два подхода должны оказаться очень полезными в дальнейших исследованиях с использованием мутантов вируса гриппа. Во-первых, первичное повреждение у большого количества нетекущих мутантов с повреждениями в отдельном сегменте РНК генома вируса гриппа должно быть установлено при тщательном изучении каждой из установленных стадий репликационного цикла. Использование коров для сравнения in vitro активностей вирионной транскриптазы ts-мутанта и вируса дикого типа должно оказать существенную помощь в расшифровке данных по инкубации при ограничите.11ьной температуре [274]. Недавно разработанные методы, в которых используются клонированные копии индивидуальных сегментов РНК [264], могут быть применены для проведения более прямого анализа фенотипа РНК но сравнению с тем, чтО было возможно до настоящего времени. И наконец, применение метода двухмерного электрофореза в геле в сочетании с изоэлектрическим фокусированием или электрофорезом в неравновесном градиенте pH дает значительные преимущества в характеристике изменений фенотипа в клетках, инфицированных мутантным ви- [c.240]

Основные принципы двухмерного электрофореза в полиакриламидном геле были сформулированы Раймондом [1062]. Он показал, что электрофорез на пластинах полиакриламидного геля в двух направлениях (ортакрильная методика — от англ. orthogonal и a rylamide) позволяет получить информацию о распределении сходных белков по зарядам и размерам. [c.228]

Иомен и др. [1468], а также Оррик и др. [943] разделили суммарные белки из ядер печени крыс и асцитной renaTOMbi Новикова методом двухмерного электрофореза в полиакриламидном геле. В первом направлении электрофорез проводил в 10%-ном полиакриламидном геле, содержавшем 0,9 М уксус- [c.307]

Pu . 81. Двухмерный электрофорез белков E. oli 5333 [935]. Первое направление— изоэлектрофокусирование (ИЭФ) в амфолинах с pH 5—7 второе направление-электрофорез в ДСН-содержашем полиакриламидном геле с градиентом концентрации геля 9—15%. Нанесено около 15 мкг белка (300000 имп./мин). Белки локализовали методом радиоавтографии. [c.233]

Показано, что описанный метод обладает высокой воспроизводимостью и большой разрешающей способностью. Он позволяет обнаружить и количественно определить с помощью радиоавтографии белок, составляющий 10 —10 % общего количества белков в образце, что свидетельствует о его высокой чувствительности. Проведение двухмерного электрофореза не требует специального оборудова1ния. Первый этап разделения осуществляют обычно в цилиндрических гелях, для которых подходит любой прибор, предназначенный для диск-электрофореза. Точно так же на втором этапе используют любой тип приборов, пригодных для электрофореза на пластинах геля. Сконструированы также специальные приборы для двухмерного электрофореза. Кальтшмидт и Витманн, [654] описали прибор, в котором одновременно можно проводить электрофорез на 5 пластинах геля. [c.234]

Если полоски крахмального геля отбирают для иммунодиффузии путем сравнения с параллельной окрашенной полоской,, то следует учитывать, что гель сжимается в процессе окрашивания и обецвечивания. Для предотвращения ошибок на этом этапе Паулик [1030] рекомендует перед разрезанием блока геля на пластинки на его смежных сторонах вырезать через рдв-ные интервалы отверстия. При сопоставлении окрашенных и неокрашенных пластинок геля эти отверстия служат указателями для последующего вырезания участков геля, содержащих анализируемые антигены. Паулик провел иммунохимический анализ, выявив таким способом локализацию фракций, разделенных двухмерным электрофорезом в крахмальном геле [1030]. [c.244]

Другой способ количественного определения белков основан нэ элюции красителя из белковых зон после окрашивания и обесцвгечивания электрофореграмм в стандартных условиях. Феннер и др. [374] рашивали гели 0,5%-ным раствором кумасси яркого синего R-250 в 50%-ном водном метаноле, содержавшем 7,5% уксусной кислоты, по методу, который предложили Бикл и Траут [119]. После обесцвечивания фона окрашенные зоны вырезали и краситель экстрагировали из кусочков геля 25%-ным водный пиридином (объем/объем), встряхивая их при комнатной температуре до тех пор, пока не наступало равновесие, что определяли путем повторных измерений поглощения раствора. Пиридин смещает максимум поглощения красителя с 550 до 605 нм, поэтому измерение поглощения проводили при 605 нм. Этот метод позволяет определять белки в пределах 1 — 100 мкг. Он особенно полезен при двухмерном электрофорезе на пластинах геля, поскольку их сканирование представляет в настоящее время определенные технические трудности. [c.270]

Ховард и Троут [585, 586] описали микросистему для двухмерного электрофореза рибосомных белков. В первом направлении они использовали трубки длиной 120 мм, а во втором — пластинки размером 150X130 мм. Такая методика позволяла разделять около 0,1 мг рибосомных белков. [c.313]

Очень важным этапом в методах двухмерного электрофореза является вымачивание гелей в буфере, применяемом для диализа, перед разделением белков во втором направлении. При длительном вымачивании, необходимом для изменения pH геля, могут происходить потери белка. Для устранения этой опасности Эвитал и Элсон [68] предложили другие способы под-кисления гелей после электрофореза в первом направлении. По предложенной ими методике разделение в первом направлении проводят так же, как в исходном методе Кальтшмидта и Уитмена [654], а затем гели либо погружают на несколько минут в охлажденную 0,3 н. НС1, либо помещают в закрытую камеру, заполненную парами хлористого водорода. Для установления необходимого времени инкубации можно использовать контрольные гели, содержащие соответствующий кислотно-щелочной индикатор. [c.313]

Во второй группе методов двухмерного электрофореза разделение рибосомных белков проводят в буферной системе, аналогичной системе Рейсфелда и др. [1072]. Далее гели помещают в раствор, содержащий ДСН, меркаптоэтанол, фосфатный буфер и 5—6 М мочевину, и инкубируют не менее 30 мин при осторожном покачивании. Затем проводят электрофорез во втором направлении на пластине геля, содержащего ДСН. Концентрация акриламида в этом геле обычно выше, чем в геле первого направления. Описано несколько вариантов метода, основанного на таком принципе [506,, 596, 827, 943]. [c.313]

Дальнейшее повышение разрешения обеспечивает двухмерный электрофорез. Описано множество различных комбинаций, таких, например, как электрофорез на фильтровальной бумаге в первом направлении и электрофорез в крахмальном геле — во втором [1031] электрофорез на ацетате целлюлозы в первом направлении и ИЭФ — во втором [944] ИЭФ на первом этапе и электрофорез в полиакриламидном геле — на втором [270, 1127]. Самые лучшие результаты получают при использовании на первом этапе электрофореза в мягких полиакриламидных гелях или ИЭФ, а на втором — электрофореза в градиенте концентрации полиакриламидного геля. Таким путем Райт [1452] изучал белковый состав нормальных сывороток и сывороток больных с некоторыми видами злокачественных опухолей (рис. 103). Основные классы иммуноглобулинов давали при этом дискретные зоны. Постальбуминовая зона разделялась [c.333]

Рис. 103. Двухмерный электрофорез в полиакриламидном геле сыворотки больных с множестве,иной миеломой [452]. Лп — Р-липопротеид, М — огмакрогло-булин Гп — гаптоглобин Тф — трансферрин А — альбумин [452].

Двухмерная система электрофореза была применена также для разделения транспортных РНК [1232]. Первый этап осуществляли в 15%-ном полиакриламидном геле, содержавшем МЕ5-буфер (pH 5,8) и мочевину. В этой системе транспортные РНК, выделенные из клеток Е. соН, разделялись на 15 зон. Разделение во втором натграв-лении проводили в 16%-ном полиакриламидном геле, содержавшем трис, борную кислоту и ЭДТА [984]. Результаты двухмерного электрофореза такого типа приведены на рис. 122. Следует отметить, что после электрофореза при pH 5,8 транспортные РНК можно пометить прямо в геле радиоактив ными аминокислотами, что помогает идентифицировать разделенные зоны. [c.380]

Рис, 122, Схема разделения тРНК Е. соИ методом двухмерного электрофореза в полиакриламидном геле [1232]. Стрелками указаны направления электрофореза, а рядом приведены значения pH соответствующих буферных растворов. Наиболее интенсивно окрашенные зоны на схеме обозначены точками. [c.380]

Рис, 127, Двухмерный электрофорез гликозаминогликанов на пленках из ацетата целлюлозы [524]. ГЯ —гепарин, Г/( гиалуроноеая кислота, ДС дер-матансульфат, Х4С — хондроитин-4-сульфат, Х6С — хондроитин-б-сульфат, /(С — кератансульфат. Буферные системы в первом направлении — 0,1 М пиридин—0,47 М муравьиная кислота (pH 3,0) во втором направлении — [c.397]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология