Электрофорез в полиакриламидном очистка антител

К насыщенному раствору (NH4)2S04 добавляют 2 н. NaOH и доводят pH до 7,8. При постоянном перемешивании медленно, по каплям к 50 мл сыворотки кролика добавляют 80 мл насыщенного раствора сульфата аммония (pH 7,8) и перемешивают в течение 2—3 ч. Центрифугируют суспензию при комнатной температуре 30 мин при 1500 g. Первый осадок содержит все -у-глобулины, другие глобулины и следы альбумина. Растворяют осадок в дистиллированной воде до начального объема сыворотки (50 мл). Очищают фракцию у-глобули-нов вторым и третьим осаждениями. После третьего осаждения растворяют осадок в боратном буфере (pH 8,45) до конечного объема 20— 25 мл. Удаляют сульфат аммония диализом при 4°С против боратного буфера в течение 2—3 дней со сменой буфера утром и вечером. Полученный после диализа препарат иммуноглобулинов обычно содержит небольшой осадок денатурированного белка и слегка опалесцирует. Центрифугируют при 4° С в течение 30 мин при 1400 s. В полученном препарате проверяют содержание белка и титров антител. Определяют белковый состав методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН (с. 119). Если полученный препарат у-глобулинов не отвечает требованиям эксперимента по стоте, проводят дальнейшую очистку с применением ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. [c.308]

Многие интерфероны были в последнее время успешно очищены. Наиболее эффективные этапы очистки включают хроматографию на голубой сефарозе и веществах, хелатирующих Си и Zn [21, 127], адсорбционную хроматографию на пористом стекле [116, 267, 279] и иммуноаффинную хроматографию с использованием как поликлональных, так и моноклональных антител [30, 170]. Процедуры очистки с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии и электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН позволяют одновременно получать интерфероны разных классов [99]. [c.54]

Один весьма успешный способ преодоления этой трудности заключается в отделении нужного фермента от других белков с помощью гель-электрофореза [100]. Образец фермента наносят на довольно крупнопористый гель и электрофорез продолжают до тех пор, пока фермент четко не отделится от всех сопутствующих примесей. После локализации положения фермента в геле последний разрезают и слой, содержащий фермент, растирают до получения тонкой суспензии, состоящей из полиакриламидного геля и фермента. Эту суспензию и используют затем для первой инъекции нескольких сотен микрограммов белка оказывается вполне достаточно. Иммуноглобулины, полученные таким способом, содержат до 10% антител к нужному ферменту. Остальные 90% — это относительно неспецифические иммуноглобулины, присутствующие в организме животного к моменту иммунизации. К 1 см агарозы можно присоединить десятки миллиграммов иммуноглобулина, [101]. При этом на 1 смз геля будет приходиться до 1 мг специфических антител. Но, поскольку молекулы антител присоединяются к адсорбенту таким образом, что это приводит в большинстве случаев к потере их способности связывать антиген, концентрация активных антител будет составлять, вероятно, лишь около 0,1 мг/см Если каждая молекула этих антител связывает одну молекулу антигена с близким значением молекулярной массы, то емкость такой колонки будет порядка 0,1 мг/см , это небольшая, но вполне достаточная емкость для очистки малых [c.174]

В 34 главах изложены методы определения, выделения и очистки антител (включая дансилироваиие, двумерную хроматографию, изоэлектрофокусирование, электрофорез в полиакриламидном геле и изотахофорез) методы определения констант равновесия (равновесный диализ, равновесная фильтрация и седиментация) способы маркировки реагентов изотопами и флуоресцентными красителями и определение компонентов клеточной поверхности меры предосторожности при работе в изотопной лаборатории методы химической модификации белков, гаптенов и нерастворимых носителей приемы получения аитн-сывороток к аллотипам и антигенам гистосовместимости и получения антител доминирующего клонотипа методы оценки гистосовместимости и реакций в смешанной культуре лимфоцитов методы разделения клеток на гелях, несу- [c.7]

С помощью одних и тех же антисывороток перекрестный ИЭФ позволяет выявить большее число антигенов, чем простой ИЭФ. Дополнительное преимущество — это возможность очистки антигенов. Наибольшая ценность перекрестного ИЭФ заключается в том, что он позволяет определять специфичность антител в неденатурирующих антигены условиях. В то же время электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ДСН с последующим Вестерн-блоттингом и иммунохимиче-ским окрашиванием хотя и обладает очень высокой чувствительностью, однако позволяет обнаружить только те антигенные эпитопы, которые не изменяются после денатурации. [c.228]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология