Сефароза голубая

Сефароза Сефароза 4В Голубая сефароза 6В [c.300]

В противоположность частично очищенному препарату гомогенная по данным электрофореза НАД-киназа из сердца голубя утрачивает способность к ассоциации — диссоциации. При гель-фильтрации такого препарата через колонку с сефарозой 6В НАД- [c.139]

Многие интерфероны были в последнее время успешно очищены. Наиболее эффективные этапы очистки включают хроматографию на голубой сефарозе и веществах, хелатирующих Си и Zn [21, 127], адсорбционную хроматографию на пористом стекле [116, 267, 279] и иммуноаффинную хроматографию с использованием как поликлональных, так и моноклональных антител [30, 170]. Процедуры очистки с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии и электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН позволяют одновременно получать интерфероны разных классов [99]. [c.54]

Изящный вариант каскадной методики такого типа был продемонстрирован недавно на примере выделения цитрат-син-тетазы (К. Ф. 4.1.3.7) и фумаразы (К. Ф. 4.2.1.2) с использованием одной и той же аффинной колонки, содержащей пиромел--литовую кислоту (ПМК), присоединенную к сефарозе 4В через пространственную группу диаминопропанола. Экстракт ткани наносят на колонку с ПМК-сефарозой 4В в 0,01 М фосфатном буфере (pH 7,3), содержащем 0,01 М меркаптоэтанол. Цитрат-синтетаза сорбируется полностью, в то время как связывание фумаразы в присутствии фосфата подавляется (фосфат — конкурентный ингибитор этого фермента). Цитрат-синтетазу элюируют тем же буфером, содержащим 0,01 М лимонную кислоту. Полученный элюат наносят на колонку с гелем голубой сефарозы 4В, где фермент связывается количественно, и далее элюируют 0,01 М фосфатным буфером (pH 7,3), содержащим меркаптоэтанол (но не содержащим лимонной кислоты). Фракцию фумаразы, не сорбированную на ПМК-сефарозе 4В в условиях элюирования фосфатом и содержащую 100% ферментативной активности, подвергают диализу против 0,01 М трис-ацетатного буфера (pH 7,3), содержащего 0,014 М меркаптоэтанол и наносят на колонку с ПМК Сефарозой 4В в указанном буфере. При этом наблюдается количественное связывание фермента, элюирование которого проводят в присутствии ь-яблочной кислоты и далее, после удаления последней, фумаразу сорбируют на колонке с голубой сефарозой, а затем проводят элюирование, вновь добавляя яблочную кислоту в рабочий трис-ацетатный буфер. [c.190]

После уплотнения геля, удалив воздух, смешивают порцию сыворотки с голубым декстраном, по<мещают его в колонку и производят разделение при несколько меньшем давлении, г 3. Собирают элюат порция м .и по 5 мл, вымывая IgM с красящей меткой. Вместо сефакрила S300 можно использовать сефарозу 4В или 6В или сефакрил S200. [c.108]

Рис. 4-3. Подготовка мини-колонки для микроварианта гель-хроматографии. В голубом наконечнике для эппендорфовской пипетки на 1,0 мл (А1) отверстие закрывают стеклянной ватой А2). Нагретым металлическим пробойником в крышке (A3) пробирки для замораживания (объем 2,0 мл, диаметр 12 мм) A4) делают отверстие. В стенке этой пробирки делают маленькое отверстие иглой (показано стрелкой). Колонку собирают (Б), заполняют ее сефарозой L-4B до верхней части наконечника (В) и центрифугируют в мини-фуге 2 мин при 1000 об/мин. Г. Колонка готова для загрузки раствором плазмидной ДНК.

С аффинной хроматографией во многом сходна хроматография, при которой в качестве лигандов используются красители (голубая, зеленая или красная сефароза), а также хроматография на гидрофобных лигандах, где носителем является октил- или фе-нилсефароза. В первом случае в качестве иммобилизованного лиганда используют органический краситель, являющийся аналогом субстрата, кофермента или аллостерического эффектора. Элюирование обычно осуществляют солевым раствором увеличивающейся концентрации. [c.70]

При изучении свойств НАД-киназы из скелетных мышц использовали высокоочищенные, но ие гомогенные препараты НАД-киназы. Препарат фермента из сердца голубя был электро-форетически получен в гомогенном состоянии. Метод выделения и очистки в качестве последних стадий включал ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-сефадексе А-50 и гель-фильтрацию на сефарозе 6В [5]. Сравнение свойств частично очищенных и гомогенных, по данным электрофореза, препаратов фермента позволило установить следующую закономерность. Частично очищенные ферментные препараты НАД-киназы из сердца голубя подобно ферменту из скелетных мышц кролика гетероген ны и представлены не менее чем пятью молекулярными формами, число которых могло варьировать от препарата к препарату НАД-киназную активность проявляли формы с молекулярными весами, равными 300 000—270 000, 230 000—200 000, 180 000, 120 000 и 45 000. Из распределения общей активности фермента между различными молекулярными формами следует, что большая часть НАД-киназы представлена олигомерами с молекулярным весом 180000. [c.138]

Несмотря на довольно убедительные данные [102] об эффективности применения вышеуказанных сорбентов для очистки ряда рестриктаз, они практически не получили распространения в этой области препаративной биохимии ферментов. Хроматографическое фракционирование на голубой сефарозе было включено как одна из стадий очистки рестриктаз Мга I [289] fl I, Gal i и Gee i [121] и при получении гомогенных препаратов Pal I [33] и Mva I [29]. Пиран сефароза нашла применение в ходе выделения функционально очищенных Nsp рестриктаз из Nosto РСС7524 [211]. [c.157]

В большинстве случаев для получения функционально очищенных препаратов рестриктаз необходимо проведение 2— 4 стадий очистки, в том числе 1—-3 хроматографических. Некоторые схемы выделения оказались приемлемыми для выделения многих рестриктаз. Среди таких можно отметить схемы, включающие стадию удаления нуклеиновых кислот гельфильтрацией или путем их высаждения при помощи СС или ПЭИ, высаливание сернокислым аммонием (не во всех случаях) и последовательную хроматографию на ФРП и ДЭАЭц в указанном или обратном порядке [28, 62, 89, 90, 92, 98, 104, 122, 156, 164, 166, 167, 180, 186, 218, 219, 220, 224, 225, 247, 262, 265, 271, 294, 296, 297 и др.]. Включение в схемы выделения наряду с указанными ионитами или вместо одного из них ГС [43, 44, 68, 85, 91, 130, 145, 173, 249, 262, 282, 293 и др.,] или ГАП [17, 23, 38, 88, 105, 202, 203, 209, 288 и др.] еще более расширяет список рестриктаз, очищенных с использованием ограниченного набора сорбентов. Реже в схемы очистки включается карбоксиметилцеллюлоза [106], ДНК-агароза/целлюлоза [58, 146, 174], w-аминопентилсефароза [31, 100, 303], фенилсефароза [18, 27], голубая сефароза [18, 32, 102, 211, 289], гельфильтрация с использованием се- [c.158]

К попыткам создания унифицированной схемы очистки рестриктаз можно отнести и работу Бекси [32], апробировавших с этой целью прямое фракционирование бесклеточных экстрактов четырех продуцентов рестриктаз различной таксономической принадлежности на голубой сефарозе. Однако, эффективность этого метода была продемонстрирована на небольшой группе рестриктаз и для определения его универсальности необходимы дополнительные исследования. [c.159]

В большинстве случаев выделения гомогенных препаратов рестриктаз для удаления нуклеиновых кислот используется их высаждение при помощи СС или ПЭИ [13, 72, 106, 107, 127, 138, 184, 299, 234], что, учитывая простоту масштабируемости этого приема, является вполне понятным. Имеются примеры использования для разделения нуклеиновых кислот и целевых ферментов на первой стадии препаративных опытов сорбентов, в том числе ФРП [29, 34, 80, 254], гепаринсефарозы [196] голубой сефарозы [33] и ДЭАЭц [74]. В цитированных случаях только в случае выделения Bgl I [163] грубые экстракты перед нанесением на сорбенты подвергались высаливанию. [c.166]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология