Иммуноаффинная хроматография

Рис. 6.8. Очистка химерного белка с помощью иммуноаффинной хроматографии. Антитела к маркерному пептиду химерного белка фиксируют на твердом носителе и пропускают через колонку химерный белок. Маркерный пептид, входящий в состав химерного белка, связывается с антителами, а все остальные белки свободно проходят через колонку. Очищенный химерный белок элюируют из колонки.

В случае хранения в замороженном состоянии при —20 °С рекомендуется разделять антисыворотку на партии небольших объемов, чтобы не подвергать ее многократному замораживанию и размораживанию. При использовании некоторых методов необходимо, чтобы иммуноглобулины IgG были отделены от других сывороточных белков. Осаждение сульфатом аммония или комбинирование этой операции с ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе [31, 36] или с аффинной хроматографией при использовании белка А, иммобилизованного на носителе [48], позволяет легко, но более или менее тщательно очистить эти иммуноглобулины. Иммуноаффинная хроматография, используя очищенный иммобилизованный антиген, дает возможность производить очистку специфических антител белка при разделении фракции IgG или даже антисыворотки. [c.97]

Подготовка колонки для иммуноаффинной хроматографии [c.115]

Гомогенность и специфичность центров связывания моноклональных антител делают их особенно удобными для использования в иммуноаффинной хроматографии. В табл. 6.15 мы приводим высокоэффективный метод получения иммуносорбентов для колонок и их применения, а также различные варианты условий элюции, которые позволили нам очень эффективно с сохранением их биохимической активности очистить макромолекулы, обладающие высокой чувствительностью к воздействию оазличпых агентов и находящиеся в низкой концентрации. [c.196]

В том случае, когда количество исследуемого антигена достаточно только для первоначальной иммунизации, используют другой вариант иммуноаффинной хроматографии, разработанный сравнительно недавно. Полученные антитела иммобилизуют на нерастворимом носителе и экстракт, содержащий антиген, наносят на колонку. Десорбцию осуществляют обычным способом. Однако при приготовлении сорбента, сорбции и элюировании необходимо иметь в виду высокую лабильность антител в присутствии денатурирующих агентов. [c.188]

GGT из почек крысы. Для очистки легкой формы GGT из. почек крысы можно воспользоваться описанной выше методикой для проведения иммуноаффинной хроматографии на иммобилизованных антителах против GGT из почек крысы. Фермент, элюированный водой, обладает в 330 раз большей активностью, чем исходный гомогенат при суммарном выходе 46%. Данные по очистке суммированы в табл. 6. [c.159]

Необратимость взаимодействия клеток с аффинным носителем хотя адсорбция клеток на специфических иммобилизованных лигандах зачастую достигается легко, постоянно возникали трудности при последующем выделении связавшихся клеток с применением методов, совместимых с жизнеспособностью клеток. Одна из причин этих трудностей — многоточечное связывание между клеткой и носителем каждая клетка обладает многочисленными рецепторами для иммобилизованного лиганда, причем несколько молекул лиганда сами связаны с одной и той же частицей матрицы или поверхности. Второй причиной необратимого связывания клеток с аффинным носителем может быть очень высокое сродство между иммобилизованным лигандом и его рецептором на поверхности клетки, которое часто возникает, если узнавание клетки и лиганда основано на взаимодействии антиген — антитело это весьма серьезное ограничение при выделении жизнеспособных клеток иммуноаффинной хроматографией. [c.247]

Многие интерфероны были в последнее время успешно очищены. Наиболее эффективные этапы очистки включают хроматографию на голубой сефарозе и веществах, хелатирующих Си и Zn [21, 127], адсорбционную хроматографию на пористом стекле [116, 267, 279] и иммуноаффинную хроматографию с использованием как поликлональных, так и моноклональных антител [30, 170]. Процедуры очистки с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии и электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН позволяют одновременно получать интерфероны разных классов [99]. [c.54]

Еще одна проблема - невысокая стабильность белков, кодируемых клонированными генами. Рекомбинантный белок может расщепляться про-теиназами хозяйской клетки. Чтобы избежать этого, можно изменить клонированный ген таким образом, чтобы на N-конце белковой молекулы оказались одна или несколько дополнительных аминокислот. В такой форме рекомбинантный белок уже не подвергается столь быстрой деградации. Кроме того, лишние аминокислоты иногда помогают в последующей очистке химерного белка, например с помощью иммуноаффинной хроматографии на колонке. При этом место соединения компонент подбирается так, чтобы по нему можно было расщепить молекулу (химическим или ферментативным путем) и получить эти компоненты в чистом виде. [c.130]

Молекула целлюлазы обычно состоит из трех доменов каталитического, шарнирного, часто обогащенного остатками пролина, серина и треонина, и связывающего целлюлозу. Каталитический и связывающий домены функционируют независимо друг от друга. Такое разделение функций можно использовать, включив нуклеотидную последовательность связывающего целлюлозу домена в состав химерного гена, другая часть которого кодирует представляющий коммерческий интерес белок. Чтобы очистить полученный белок, его экстракт пропускают через колонку, набитую целлюлозой. С целлюлозой связывается только гибридный белок его элюируют и удаляют целлюлозный домен протео-лизом. Эта система сходна с иммуноаффинной хроматографией, но обходится дешевле. [c.300]

Иммуноаффинная хроматография (Immunoafflnity hromatography) Метод очистки, при котором фиксированное на матрице антитело связывает специфичесыш белок, присутствующий в сложной смеси других белков. [c.549]

Как это детально показано в разд. 6.3, антитела проявляют высокое сродство соответствующим антигенам и наоборот. Трудности их освобождения из комплексов 0бусл0 Влены именно этим сильным взаимодействием. Использования сильных хаотропных элюентов в иммуноаффинной хроматографии можно избежать путем химической модификации иммобилизованных аффинных лигандов [39]. Например, элюирование антиглюкагоновых антител из колонки с иммобилизованным глюкагоном может быть осуществлено в мягких условиях, если частично нарушить пространственную комплементарность к связывающему участку антитела путем избирательной модификации гормона, например реакцией с 2-окси-5-нитробензилбромидом, тетранитрометаном или перекисью водорода. [c.107]

Эффективность аффинной хроматофафии зависит преимущественно от выбора лиганда или акцептора, который определяет природу вьщеляемого мембранного белка. Существенным фактором в этом случае является сродство лиганда к рецептору, и поэтому самыми эффективными лигандами оказываются специфические блокаторы или антагонисты нейрорецепторных белков. Иногда для вьщеления конкретного белка используют две или три ступени аффинной хроматофафии на разных сорбентах и с разньаш лигандами. Получили широкое распространение методы иммуноаффинной хроматографии, в которых в качестве лиганда используется поликлональные или моноклональные антитела, полученные к компонентам рецептора. [c.268]

Описано много методов очистки различных форм GGT из разных тканей и жидкостей организма как правило, все предлагаемые методики многостадийны, а выходы относительно низкие. Кроме того, GGT вследствие различий в содержании углеводов и сиаловой кислоты имеет мультимолекулярные формы с различными изоэлектрическими точками, которые плохо разде ляются ионообменной хроматографией или аффинной хроматографией на иммобилизованном конканавалине А. Поэтому очистка различных форм GGT с применением иммуноаффинной хроматографии представляется эффективным альтернативным методом. [c.152]

Антигены, Антигены, используемые для иммунизации, должны быть очень хорошо очищены, для чего можно использовать метод иммуноаффинной хроматографии или классические методы . Чистая GGT из почек быка может быть выделена солюбилизацией фермента в присутствии дезоксихолата натрия с последующей обработкой -бутанолом, фракционированием сульфатом аммония и хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе [27]. Полученный после разделения на сефарозе 6В препарат GGT подвергается протеолитическому гидролизу бромелаином, и полученная GGT (легкая форма) очищается электрофорезом в полиакриламидном геле [28]. Чистая GGT из почек крысы (фермент П1) может быть получена [29] подобным методом. [c.153]

При анализе методом двойной иммунодиффузии препарат GGT, очищенный из почек быка с применением иммуноаффинной хроматографии, дает с гомологичными антителами три отдельные дуги преципитации, каждая из которых проявляет GGT-активность. Ферментный препарат может быть также разделен на четыре активные фракции изоэлектрическим фокусированием. GGT из почек крысы, очищенная на иммуноадсорбенте, дает с гомологичными антителами две дуги преципитации, обладающие ферментативной активностью. Эти наблюдения подтверждают предположение, что GGT присутствует в виде нескольких молекулярных форм, которые могут отличаться по содержанию сиаловой кислоты. Тэйт и Мейстер [34] впервые продемонстрировали, что чистая легкая форма GGT из почек крысы может быть разделена на несколько ферментных форм. Эти наблюдения делают очевидным тот факт, что молекулярные формы, очищенные на иммуноадсорбентах, иммунологически неразличимы. [c.162]

В течение второго периода, длившегося с середины 60-х до середины 70-х гг., на очистку интерферона не жалели усилий. Важным достижением, полученным в ходе этих работ, которые наконец увенчались успехом [126], было осознание того, что существует не один, а несколько молекулярных видов каждого из интерферонов человека (а и р). Это подготовило почву для последующего открытия семейств интерфероновых генов (см. ниже). Использовали два приема, оказавшихся решающими для очистки интерферона иммуноаффинную хроматографию и нечувствительность интерферона к додецилсульфату натрия (ДСН) последняя позволила применить электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ДСН как эффективный заключительный этап очистки. Электрофорез показал, что интерфероны, точнее р-интерферон, представляют собой гликопротеины. По данным Дорнера и сотр. [58], довольно широкая полоса, которую дает р-интерферон в геле с ДСН, существенно сужается, если интерферон сначала обработать гликозидазами. [c.37]

Для HBV разработано несколько методов получения поверхностного антигена в клетках эукариот. Стимулом для этих разработок послужила острая необходимость в дешевой вакцине. Хотя имеющаяся в настоящее время разрешенная вакцина против HBV, содержащая (22 нм)-поверхностный антиген гепатита В (HBsAg), который получен из плазмы хронически инфицированных носителей, защищает от заболевания, высокая стоимость препятствует ее использованию в развивающихся странах, где нужда в эффективной иммунопрофилактике особенно велика. Возможно, эта ситуация скоро будет исправлена, поскольку в настоящее время антиген HBsAg получают из дрожжей в количествах, очевидно, достаточных для его поступления в продажу. Его экспрессия достигается при трансфекции дрожжей рекомбинантом, который содержит ген поверхностного антигена HBV, встроенный в плазмиду за индуцируемым промотором [ИЗ, 186]. Продуцируемый дрожжами HBsAg, очевидно, не гликозилирован, но иммуногенен в организме шимпанзе. После разрушения дрожжевых клеток антиген очищают с помощью изопикнического и скоростного зонального центрифугирования в комбинации с иммуноаффинной хроматографией [16, 186, 189]. [c.156]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология